Патенты автора Кругликов Владимир Дмитриевич (RU)
Данное изобретение относится к микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при проведении мониторинга за холерой, планировании противоэпидемических мероприятий и исследований, связанных с изучением особенностей биологии возбудителя. Описан способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, проведение ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации. Амплификацию исследуемой ДНК проводят одновременно с пятью парами праймеров, при этом в инкубационную смесь вносят 0,5 мкл интеркалирующего красителя 50Х SYBR Green I для выявления продуктов амплификации по динамике изменения показателя флюоресценции по каналу FAM амплификатора. Учет результатов осуществляют по геометрическому методу, путем регистрации Дельта Ср, отраженному на экране монитора, а именно: при наличии целевого продукта генов ACD-rtxA, tcpA, vce, vspD, vgrG3 формируется амплификон с низким показателем Ср, в пределах (8-15) циклов, подтверждая присутствие тестируемого гена типичных O1 и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 El Tor, в случае отсутствия специфической мишени реакция с парами праймеров образует амплификон с более высоким показателем Ср, в пределах (21-29) циклов, подтверждая отсутствие тестируемого гена. Технический результат заключается в создании простого быстрого и достоверного способа молекулярного типирования штаммов с помощью ПЦР с последующим электрофоретическим учетом результатов типичных и атипичных (RО) нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae El Tor. 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 4 пр.
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной биотехнологии, и может быть применено при создании иммуноферментных диагностических тест-систем для идентификации штаммов V cholerae 01 в лабораторной практике. Сущность изобренения заключается в том, что получают штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L. ГX-A5D8/Omp - продуцент моноклональных антител, специфичных к мембранному белку, общему для типичных и атипичных холерных вибрионов 01 серогруппы, депонированный под номером Н-60 в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». 2 ил., 1 табл., 4 пр.
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Изобретение может быть использовано при изучении нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения на молекулярно-биологическом уровне с целью установления их роли в этиологии спорадических случаев и вспышек диарейных заболеваний. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что для проведения ПНР используют 14 генов, оптимально определяющих генотип нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 серогруппы, а именно: rstA, tcpA, int, nanH, vce, rtxC, acd-rtxA, vcsN, vspD, vasK, pbd-vgrG3, acd-vgrG1, mshA, stn/sto. Реакцию проводят отдельно для каждого гена в 10 мкл смеси с праймерами, соответствующими определенному гену, и осуществляют амплификацию на программируемом многоканальном термостате при определенных режимах. После окончания реакции смесь окрашивают бромистым этидием и разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном либо трис-боратном буфере, затем в трансэллюминаторе считывают длину амплификата каждого фрагмента, которые имеют следующие размеры: rstA - 1009 п.н., tcpA -471 п.н., int - 458 п.н., nanH- 585 п.н., vce - 1009 п.н., rtxC - 417 п.н., acd-rtxA - 660 п.н., vcsN - 508 п.н., vspD - 422 п.н., vasK - 614 п.н., pbd-vgrG3 - 422 п.н., acd-vgrG1 - 735 п.н., mshA - 432 п.н., stn/sto - 172 п.н., анализ результатов проводят, сравнивая выделенные детерминанты нуклеотидных последовательностей генов исследуемого штамма с длиной амплификата контрольных штаммов: V. cholerae O1 № M - 878 и №14863, а также ПЦР-амплификат этого гена, полученного на матрице ДНК штамма V. cholerae nonO1/non O139 (NRT 36), затем полученный результат сравнивают с табличными значениями общей характеристики генотипов нетоксигенных штаммов O1 серогруппы, по которому определяют идентичность генотипа. При этом реакционная смесь для ПЦР имеет следующий состав: 10-х буфер для амплификации (рН 8,8) - 1 мкл; 2,5 мМ раствор смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTR) - 1 мкл; 2,5 мМ раствор прямого и обратного праймеров определенного гена - 1 мкл; ДНК-матрица исследуемого штамма - 1 мкл; TAQ-полимераза (5 ед./мкл) - 0,1 мкл; деионизированная вода - 6,9 мкл. Кроме того, амплификацию проводят при следующих режимах: для определения генов rstA, ACD-rtxA, tcpA, int, nanH vce, mshA, vasK, acd-vgrG1, pbd-vgrG3: денатурация - 94°C, 3 мин (1 цикл); отжиг - 58°C, 30 сек; синтез - 72°С, 30 сек (30 циклов); досинтез - 72°С, 3 мин (1 цикл); для определения гена rtxC, vcsN2, vspD: денатурация - 94°С, 3 мин (1 цикл); отжиг - 55°С, 30 сек; синтез - 72°С, 30 сек (30 циклов); досинтез - 72°С, 3 мин (1 цикл); для определения гена : денатурация - 94°С, 3 мин (1 цикл); отжиг - 50°С, 30 сек; синтез - 72°С, 30 сек (30 циклов); досинтез - 72°С, 3 мин (1 цикл). 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к методам контроля биологических свойств штаммов пробиотических бактерий, используемых при производстве пробиотиков, и может быть использовано для оценки биологической активности лактобацилл и бифидобактерий по отношению к Vibrio cholerae с целью установления возможности применения пробиотиков для профилактики и лечения холеры
