Патенты автора Лисицкая Лидия Александровна (RU)
Предложен способ получения рекомбинантного экзопротеина А P. aeruginosa (rEPA). Способ включает получение экспрессионного плазмидного вектора pET-rEPA (SEQ NO: 3), содержащего промоторную последовательность ДНК бактериофага Т7 и последовательности ДНК, кодирующие N-концевую область белкового продукта энхансера трансляции (аминокислотная последовательность MASMT), шесть остатков гистидина, сайт расщепления протеазой SUMO и оптимизированную для трансляции в Е. coli последовательность (SEQ NO: 1), кодирующую рекомбинантный белок rEPA (SEQ NO: 2). Осуществляют продукцию рекомбинантного химерного белка-предшественника в гетерологичной системе экспрессии в электрокомпетентных клетках Е. coli BL21(DE3), трансформированных плазмидным вектором pET-rEPA с получением штамма Е. coli BL-rEPA, при 37°С для обеспечения накопления максимального количества белка-предшественника в растворимой фракции. Проводят лизис бактериальной массы в присутствии 4% Triton Х-100 для сохранения белка-предшественника в растворимой форме. Выделяют белок предшественник с помощью металл-хелатной хроматографии на сорбенте Talon, заряженном ионами Со2+, с последующим отщеплением гексагистидина и пептида SUMO протеазой SUMO из состава полипептида. Отщепленный рекомбинантный белок rEPA доочищают анионообменной хроматографией на сорбенте DEAE-Sepharose и гель-фильтрационной хроматографией на колонке, заполненной Superdex 200, с переводом в конечный буфер со значением рН 7.5, с получением рекомбинантного белка rEPA. Изобретение обеспечивает получение белка с высоким выходом, составляющим 0,25 г с литра бактериальной культуры. 4 ил., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и биофармакологии. Предложен способ получения рекомбинантного пептидогликан-ассоциированного липопротеина (PAL) Legionella pneumophila. Конструируют плазмиду pET22b(+)-PAL длиной 6184 п.н., несущую экспрессионную конструкцию для продукции химерного полипептида, содержащего последовательность, кодирующую белок PAL, слитую на 5’-конце с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов и пептид SUMO. Трансформируют клетки Е. coli BL21(DE3) экспрессионной плазмидной ДНК pET22b(+)-PAL. Культивируют полученный штамм BL21(DE3)-PAL при 37°C с продуцированием белка PAL в течение 3 ч. Очищают белок HIS-SUMO-PAL из растворимой фракции бактериального лизата металл-хелатной хроматографией. Отщепляют пептид HIS-SUMO обработкой SUMO-протеазой с восстановлением нативной структуры белка PAL. С помощью ионообменной и гель-фильтрационной хроматографии получают гомогенный препарат белка PAL. Изобретение обеспечивает получение белка PAL, обладающего 98% чистоты по данным электрофореза и денситометрии, с выходом не менее 300 мг с литра бактериальной культуры без ферментации, который может быть использован при разработке диагностических препаратов для определения легионеллезов. 5 ил., 3 пр.
Настоящее изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения слитого химерного рекомбинантного белка fliC:pagN. Для осуществления способа конструируют рекомбинантную плазмиду pETfliCpagN, затем трансформируют клетки Escherichia coli BL21(DE3) указанной плазмидой и культивируют полученный штамм BL-fliCpagN при температуре 37°С. Затем получают периплазматическую фракцию бактерий-продуцентов обработкой клеток лизоцимом в 20% растворе сахарозы с последующим центрифугированием, проводят очистку химерного белка fliC:pagN металл-хелатной, анионообменной и гель-фильтрационной хроматографией с получением гомогенного конечного препарата белка fliC:pagN. Рекомбинантная плазмида pETfliCpagN содержит промотор бактериофага Т7 и несёт последовательности, кодирующие белки fliC, включая лидерную последовательность данного белка, и pagN S.typhimurium, объединенные короткой линкерной последовательностью GSVDSSSGGN, и слитые на 3'-конце с синтетической последовательностью, кодирующей шесть гистидинов. Заявленный способ получения fliC:pagN позволяет синтезировать данный белок в растворимой форме с нативной N-концевой аминокислотной последовательностью, а также с выходом не менее 0,3 г белка с литра бактериальной культуры, обладающего 98% чистоты. 7 ил., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа направленного истощения олигонуклеотидных библиотек в отношении водорастворимых белковых мишеней глутатион-S-трансферазы и стрептавидина. Представленный способ включает подготовку комбинаторной олигонуклеотидной библиотеки в количестве 1015 молекул к отбору, разведение олигонуклеотидов библиотеки до концентрации 1015 молекул на 1 мл, денатурацию олигонуклеотидов при 90°С в течение 10 минут и отжиг олигонуклеотидов при 37°С. Связывание глутатион-S-трансферазы или стрептавидина в количестве 1 мг с подготовленным пулом исходной олигонуклеотидной библиотеки в буферном растворе, содержащем 20 мМ Tris-HCl рН 7,4, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, и разделение полученной смеси нуклеиновая кислота/белок-мишень гель-фильтрационной хроматографией на фракции. Изобретение позволяет элиминировать из пула олигонуклеотидов максимально возможное количество аффинных к заданной мишени молекул, а повторение раундов такой селекции гарантирует отсутствие в финальном пуле молекул олигонуклеотидов, имеющих значимую для дальнейшего применения аффинность к мишени. Изобретение может быть применено для получения выскоаффинных аптамеров, применимых в области биомедицины. 7 ил., 7 пр.
Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения рекомбинантной фосфатазы бактериальных липополисахаридов. Данный способ включает синтез оптимизированной для трансляции в E. coli последовательности ДНК, кодирующей белок фосфатазы LpxE F. novicida. Указанная последовательность ДНК представлена на Фиг.1А. Настоящий способ предусматривает последующее конструирование экспрессионного вектора, кодирующего химерный белок-предшественник с N-концевой химеризацией. Указанный белок-предшественник состоит из последовательности мальтоза-связывающего белка, сайта узнавания протеазой фактором Xa, шести гистидинов и фосфатазы LpxE F. novicida. Способ также предполагает получение рекомбинантного белка-предшественника продукцией в E. coli и его выделение и очистку. Указанный способ предусматривает последующее выщепление мальтоза-связывающего белка из состава полипептида и доочистку белка фосфатазы LpxE. Настоящее изобретение позволяет получать рекомбинантную фосфатазу LpxE F. novicida с высоким выходом. 6 ил., 5 пр.
