Патенты автора АУЭРБАХ Войтек (US)

Изобретение относится к генной инженерии. Предложен способ введения биаллельной модификации в целевой геномный локус с использованием системы CRISPR/Cas9, включающий введение Cas9, двух гидовых РНК и нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотидную вставку, фланкированную 5' гомологичным плечом, которое гибридизуется с целевой 5'-последовательностью в пределах целевого геномного локуса, и 3' гомологичным плечом, которое гибридизуется с целевой 3'-последовательностью в пределах целевого геномного локуса. Настоящий способ также включает проведение количественного теста для оценки модификации аллеля и теста на сохранение для определения числа копий в образце геномной ДНК области целевой 5'- и/или 3'-последовательности, что позволяет различить правильную нацеленную вставку полинуклеотидной вставки от случайных трансгенных вставок и/или правильные нацеленные делеции от делеций, выходящих за пределы области целевого геномного локуса. 31 з.п. ф-лы, 18 ил., 14 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу модификации целевого геномного локуса на Y-хромосоме в мышиной эмбриональной стволовой клетке (ЭС). При этом способ предусматривает: обеспечение мышиной ЭС клетки, содержащей целевой геномный локус на Y-хромосоме, причем целевой геномный локус содержит сайт распознавания для нуклеазного агента, и где мышиная ЭС клетка находится в культуре, содержащей основную среду DMEM, введение в мышиную ЭС клетку нуклеазного агента или полинуклеотида, кодирующего нуклеазный агент, причем нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв на сайте распознавания, и большого нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотидную вставку, и идентификацию по меньшей мере одной мышиной ЭС клетки, содержащей в своем геноме полинуклеотидную вставку, интегрированную в целевой геномный локус. Изобретение позволяет эффективно модифицировать целевой геномный локус на Y-хромосоме в мышиной эмбриональной стволовой клетке. 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 11 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению популяции человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), поддержанию hiPSC, модификации целевого геномного локуса в hiPSC и композиции для культивирования и поддержания hiPSC. Способ включает культивирование in vitro популяции фибробластов, трансформированных для экспрессии плюрипотентного состояния, в среде с низкой осмоляльностью от 200 мОсм/кг до 250 мОсм/кг, содержащей основную среду и полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF), ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3) и ингибитор MEK. Модификацию целевого геномного локуса в hiPSC осуществляют путем введения в hiPSC нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотидную вставку, фланкированную 5'- и 3'-гомологичными плечами, соответствующими 5'- и 3'-целевым сайтам в целевом геномном локусе или внедрения в hiPSC нуклеазного агента, который создает один или более одноцепочечных или двухцепочечных разрывов в сайте распознавания в целевом геномном локусе для создания модификации целевого геномного локуса и идентификации генетически модифицированной hiPSC, содержащей в своем геноме полинуклеотидную вставку, встроенную в целевой геномный локус. Изобретение позволяет расширить арсенал технических средств. 5 н. и 33 з.п. ф-лы, 6 табл., 6 ил., 5 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Предложены способы и композиции для модификации одного или более целевых локусов в клетке. Такие способы включают обеспечение клетки, содержащей первый полинуклеотид, кодирующий первый селективный маркер, функционально связанный с первым активным в клетке промотором, причем первый полинуклеотид дополнительно содержит первый сайт распознавания для первого нуклеазного агента. В клетку вводят первый нуклеазный агент, причем первый нуклеазный агент индуцирует одно- или двухцепочечный разрыв на первом сайте распознавания. В клетку дополнительно вводят первый нацеливающий вектор, содержащий первую полинуклеотидную вставку, фланкированную первым и вторым гомологичными плечами, которые соответствуют первому и второму целевым сайтам, расположенным достаточно близко к первому сайту распознавания. Затем идентифицируют по меньшей мере одну клетку, содержащую в своем геноме первую полинуклеотидную вставку, интегрированную в целевой локус. Изобретение может быть использовано в медицине. 35 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к способу модификации целевого геномного локуса путем гомологичной рекомбинации в мышиной эмбриональной стволовой (ES) клетке. Для осуществления указанного способа сначала в мышиную ES-клетку вводят цинковопальцевую нуклеазу (ZFN), которая осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и большой нацеливающий вектор (LTVEC). Затем осуществляют отбор целевой мышиной ES-клетки, содержащей нуклеотидную вставку в целевом геномном локусе. При этом интеграция приводит к делеции эндогенной нуклеотидной последовательности в целевом геномном локусе и замене нуклеотидной. Указанный LTVEC содержит нуклеотидную вставку, фланкированную вышележащим гомологичным плечом и нижележащим гомологичным плечом, при этом нуклеотидная вставка составляет от около 5 т.н. до около 30 т.н. и общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. Настоящее изобретение позволяет повысить эффективность нацеливания путем применения LTVEC с ZFN по сравнению с применением только LTVEC. 35 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 1 пр.

 


Наверх