Патенты автора Непомнящая Наталья Борисовна (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантной плазмиде pHlyA. Плазмида pHlyA экспрессирует клонированный ген hlyA (гемолизина) Vibrio cholerae, встроенный по сайтам BamHI-Pstl в полилинкер векторной плазмиды pQE30 под контролем Т5-промотора. Изобретение также относится к штамму Escherichia coli KM 2028. Указанный штамм является носителем плазмиды pHlyA и предназначен для продукции прогемолизина (proHlyA) Vibrio cholerae. Настоящее изобретение позволяет получать прогемолизин с высоким выходом. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Изобретение может быть использовано при изучении нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения на молекулярно-биологическом уровне с целью установления их роли в этиологии спорадических случаев и вспышек диарейных заболеваний. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что для проведения ПНР используют 14 генов, оптимально определяющих генотип нетоксигенных штаммов V. cholerae O1 серогруппы, а именно: rstA, tcpA, int, nanH, vce, rtxC, acd-rtxA, vcsN, vspD, vasK, pbd-vgrG3, acd-vgrG1, mshA, stn/sto. Реакцию проводят отдельно для каждого гена в 10 мкл смеси с праймерами, соответствующими определенному гену, и осуществляют амплификацию на программируемом многоканальном термостате при определенных режимах. После окончания реакции смесь окрашивают бромистым этидием и разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном либо трис-боратном буфере, затем в трансэллюминаторе считывают длину амплификата каждого фрагмента, которые имеют следующие размеры: rstA - 1009 п.н., tcpA -471 п.н., int - 458 п.н., nanH- 585 п.н., vce - 1009 п.н., rtxC - 417 п.н., acd-rtxA - 660 п.н., vcsN - 508 п.н., vspD - 422 п.н., vasK - 614 п.н., pbd-vgrG3 - 422 п.н., acd-vgrG1 - 735 п.н., mshA - 432 п.н., stn/sto - 172 п.н., анализ результатов проводят, сравнивая выделенные детерминанты нуклеотидных последовательностей генов исследуемого штамма с длиной амплификата контрольных штаммов: V. cholerae O1 № M - 878 и №14863, а также ПЦР-амплификат этого гена, полученного на матрице ДНК штамма V. cholerae nonO1/non O139 (NRT 36), затем полученный результат сравнивают с табличными значениями общей характеристики генотипов нетоксигенных штаммов O1 серогруппы, по которому определяют идентичность генотипа. При этом реакционная смесь для ПЦР имеет следующий состав: 10-х буфер для амплификации (рН 8,8) - 1 мкл; 2,5 мМ раствор смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTR) - 1 мкл; 2,5 мМ раствор прямого и обратного праймеров определенного гена - 1 мкл; ДНК-матрица исследуемого штамма - 1 мкл; TAQ-полимераза (5 ед./мкл) - 0,1 мкл; деионизированная вода - 6,9 мкл. Кроме того, амплификацию проводят при следующих режимах: для определения генов rstA, ACD-rtxA, tcpA, int, nanH vce, mshA, vasK, acd-vgrG1, pbd-vgrG3: денатурация - 94°C, 3 мин (1 цикл); отжиг - 58°C, 30 сек; синтез - 72°С, 30 сек (30 циклов); досинтез - 72°С, 3 мин (1 цикл); для определения гена rtxC, vcsN2, vspD: денатурация - 94°С, 3 мин (1 цикл); отжиг - 55°С, 30 сек; синтез - 72°С, 30 сек (30 циклов); досинтез - 72°С, 3 мин (1 цикл); для определения гена : денатурация - 94°С, 3 мин (1 цикл); отжиг - 50°С, 30 сек; синтез - 72°С, 30 сек (30 циклов); досинтез - 72°С, 3 мин (1 цикл). 2 з.п. ф-лы, 6 табл., 3 пр.
