Патенты автора Лапа Сергей Анатольевич (RU)
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии. Описан способ идентификации генов возбудителей пневмонии человека, шести бактериальных: Staphilococcus aureus, Steptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa и двух вирусных: SARS-CoV-2, Грипп А, включающий: а) амплификацию фрагментов видоспецифичных генов шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека путем проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с набором неиммобилизованных специфических олигонуклеотидных праймеров в реакционном объеме биологического микрочипа, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1-16, и иммобилизованных на том же биологическом микрочипе, представленных последовательностями SEQ ID NO: 17-31; б) отмывку биологического микрочипа; в) анализ картины ОТ-ПЦР на биологическом микрочипе с помощью Чип-детектора; г) визуальную интерпретацию результатов анализа. Представлен биологический микрочип, используемый в способе идентификации генов шести бактериальных и двух вирусных возбудителей пневмонии человека по п.1, с гидрогелевыми ячейками с иммобилизованными в них высокоспецифичными праймерами, представленными последовательностями SEQ ID NO: 17-31. Способ обладает высокой скоростью проведения анализа при одновременном обнаружении ряда патогенных агентов, устойчив к перекрестной контаминации благодаря закрытой реакционной камере на биологическом микрочипе, совместим со стандартными in situ амплификаторами, а также с детекторами флуоресцентного сигнала, разработанными для биологических микрочипов (чип-детекторы). 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине. В настоящем изобретении разработан способ, основанный на мультиплексной ПЦР, для видового определения шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека. Заявляемое изобретение характеризуется тем, что в нем не используется анализ 16s рибосомальной РНК, а затрагиваются только исключительно видоспецифичные гены, что резко увеличивает специфичность анализа. В отличие от аналогов, в заявляемом изобретении применен метод мультиплексной ПЦР, который позволяет выявлять в одном анализе ДНК шесть наиболее значимых возбудителей бактериальной пневмонии. Отечественных и зарубежных аналогов не описано. Изобретение может быть использовано в клинических лабораториях, специализирующихся на проведении рутинных анализов образцов пациентов с предварительным диагнозом пневмония. Разработанный метод требует стандартной квалификации лаборанта, работающего с постановкой ПЦР. Система ориентирована на применение в клинической диагностике для определения этиологии заболевания благодаря возможности дифференцировать бактериальную от вирусной и грибковой пневмонии и обеспечивает видоспецифическую идентификацию шести основных возбудителей бактериальной пневмонии человека. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 5 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности способ предполагает проведение трех последовательных раундов ПЦР с комбинаторной библиотекой и модифицированным dNTP - кандидатом для проведения SELEX. Вывод о применимости конкретного производного dNTP осуществляется по характеру изменения кривой накопления сигнала в течение трех раундов ПЦР в режиме реального времени и не требует проведения раундов селекции аптамеров. Если в процессе амплификации библиотека вырождается (становится менее представительной), значит конкретная модификация dNTP не может быть использована с выбранной полимеразой и другими выбранными условиями амплификации библиотеки, поскольку приводит к конкурентной амплификации. В случае когда характер кривой накопления сигнала не меняется, делается вывод, что используемый модифицированный трифосфат дезоксинуклеозида не влияет на распределение олигонуклеотидов с различными последовательностями в составе библиотеки, то есть не приводит к изменению ее состава с точки зрения применяемого метода детекции. Способ применим для быстрой оценки субстратной пригодности модифицированных dNTPs для проведения mod-SELEX и будет полезен при отборе аптамеров для клинической диагностики, медицины и научных исследований. 2 ил., 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, органической химии, биотехнологии, микробиологии и медицины. Заявлен способ определения субстратной совместимости модифицированных трифосфатов дезоксиуридина и ДНК-полимераз сочетанием методом количественной ПЦР и электрофореза. Сущность изобретения заключается в том, что совместимость модифицированных нуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимераз определяется сочетанием методов: количественной ПЦР в режиме реального времени на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов с вырожденной центральной частью с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице, представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB длиной 215 п.н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п.н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; электрофоретического контроля продуктов ПЦР с количественной оценкой полноразмерного продукта. Модифицированные 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфаты содержат в своей структуре функциональные группы, которые присоединены к 5-положению пиримидинового основания карбониламиноаллильным линкером, аллильная часть линкера связана с 5-положением пиримидинового основания транс-алкеновой связью. Функциональные группы представлены линейными алифатическими, разветвленными алифатическими, фенилалкильными, алкилиндольными группами. Использовали ДНК-полимеразы с отсутствующей корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, относящиеся к разным семействам - Taq (семейство А) и Vent(exo-) (семейство Б). Использовали ПЦР с регистрацией в реальном времени, (Real time PCR) по накоплению флуоресцентного сигнала от интеркалирующего красителя Eva Green (Biotium, США) с возбуждением флуоресценции на длине волны около 500 нм и регистрацией около 530 нм. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 4% агарозном геле. Визуализацию продуктов реакции осуществляли окрашиванием агарозного геля, в котором разделяли продукты ПРЦ, бромистым этидием. Количественную оценку полноразмерного продукта проводили по оптической плотности соответствующих полос в дорожках геля. Предлагаемое изобретение может быть использовано при получении модифицированных фрагментов ДНК и модифицированных аптамеров, функциональных аналогов моноклональных антител. Изобретение обеспечивает определение субстратной совместимости производных нуклеозидтрифосфатов и матричнозависимых ДНК-полимераз, предназначенных для получения высокоэффективных модифицированных ДНК-аптамеров методом SELEX. 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 104 пр., 3 ил.
Настоящее изобретение относится к области органической химии, биохимии и молекулярной биологии. Описан способ получения комбинаторных ДНК-библиотек, содержащих модифицированные нуклеотиды, предназначенные для специфического связывания с молекулярными мишенями. Сущность изобретение заключается в том, что для получения комбинаторной модифицированной одноцепочечной ДНК-библиотеки используется комбинаторная одноцепочечная ДНК-библиотека из природных нуклеотидов и комплементарная модифицированная ДНК синтезируется в ходе матрично-зависимой высокоспецифичной ферментативной реакции удлинения праймера (primer extension) при полной замене одного из природных нуклеотидов на модифицированный аналог. Для реакции удлинения праймера предлагаются Deep Vent(exo-) и KOD XL ДНК-полимеразы и модифицированные трифосфаты дезоксиуридина с заместителями по С5-положению уридинового основания, которые полностью взаимосовместимы. При синтезе модифицированных ДНК используется один тип праймеров, закрепленных на поверхности полиэтилентерефталатных микрочастиц, что позволяет отделить и отмыть микрочастицы носителя с полученными закрепленными одноцепочечными модифицированными ДНК от используемой ДНК матрицы и компонентов реакции. В состав праймеров входят группы, позволяющие селективно отщепить модифицированную ДНК от носителя, не затрагивая ее функциональную часть фотохимическим или ферментативным методами, что позволяет получить комбинаторную модифицированную одноцепочечную ДНК-библиотеку в чистом виде. Кроме того, представлена соответствующая библиотека. Изобретение расширяет способы получения ДНК-библиотек. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 пр.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и обеспечивает определение субстратной совместимости свойств производных 2`-дезоксиуридин-5`-трифосфатов и матричнозависимых ДНК-полимераз. Изобретение может быть использовано при получении модифицированных фрагментов ДНК, а также при получении высокоэффективных модифицированных аптамеров методом SELEX. 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к реагенту на основе альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности твердых микрочастиц полиэтилентерефталата (ПЭТ-микрочастицы), а также к способу сайт-специфичной ковалентной иммобилизации альфа-фетопротеина на поверхности функционализованных ПЭТ-микрочастиц за гликозидный фрагмент белка. 2 н.п. ф-лы, 11 пр., 1 ил.
Данное изобретение относится к применимым в качестве флуоресцентных меток для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР нуклеозидтрифосфатам и промежуточным соединениям для их получения. Предложены соединения формул:
, ,где Y представляет собой -(СН2)3-; -(CH2)5-; -(СН2)5CONH(СН2)3-; Х представляет собой -СН2-; -CH2CONH(CH2)5-; -CH2CONH(CH2)5CONH(CH2)5-; M+ представляет собой H+, Na+, Li+, K+, [CH3(CH2)n](4-m)NHm+, где n=0-5, m=0-4. Предложены соединения формул:
, , ,где R представляет собой -ОН; -NH(CH2)5COOH; -NH(CH2)5CONH(CH2)5COOH; m=3-5. Предложено соединение формулы
,где R представляет собой -NH(CH2)5COOH; -NH(CH2)5CONH(CH2)5COOH при m=3 или R представляет собой -ОН; -NH(CH2)5COOH; -NH(CH2)5CONH(CH2)5COOH при m=5. Предложены новые соединения, эффективные в качестве флуоресцентных меток для ферментативного маркирования ДНК в ходе ПЦР, а также новые соединения для получения указанных соединений. 7 н. и 6 з.п. ф-лы, 43 пр., 3 табл., 5 ил.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, энзимологии, биотехнологии и медицины и предназначено для получения ДНК-аптамеров. Способ включает: (а) предварительное обогащение комбинаторной ДНК-библиотеки путем образования ее комплекса с иммобилизованной белковой мишенью (альфа-фетопротеин человека; АФП) и проведения раундов селекции; (б) образование комплекса полученной библиотеки с раствором нативного (неиммобилизованного) АФП; (в) отделение комплексов ДНК/АФП от несвязавшихся ДНК-олигонуклеотидов методом акриламидного электрофореза; (г) экстракцию связавшейся с АФП ДНК из акриламидного геля при 37°С; (д) термическую диссоциацию оставшейся в виде комплекса с АФП ДНК из геля при 60°С; (е) амплификацию ДНК после термической диссоциации. После проведения раундов селекции с использованием термической диссоциации получают обогащенную ДНК-библиотеку, пригодную для секвенирования. Использование термической диссоциации, благодаря созданию более жестких условий отмывки связавшихся с мишенью ДНК-олигонуклеотидов, позволяет повысить эффективность отбора наиболее специфичных аптамеров к белковым мишеням. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 10 пр.
Группа изобретений относится к молекулярной биологии, органическому синтезу, энзимологии, биотехнологии и медицине. Предложен способ ферментативного получения модифицированных одноцепочечных ДНК для создания реагентов, способных специфично связываться с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений. Метод основан на проведении полимеразной цепной реакции, либо транскрипции, либо обратной транскрипции, либо реакции удлинения праймера с использованием модифицированных трифосфатов дезоксиуридина, немодифицированных цепей ДНК с заданной последовательностью, высокоспецифичных фланкирующих праймеров, где 3’-праймер биотинилирован по 5’-концу, полимеразы KOD XL или Deep Vent. Модифицированные цепи ДНК отделяются от немодифицированных цепей ДНК с помощью магнитных частиц с ковалентно пришитыми к их поверхности молекулами стрептавидина, либо методом с применением λ-экзонуклеазы. Полученные одноцепочечные ДНК с модификациями способны взаимодействовать с гидрофобными участками высокомолекулярных соединений-мишеней и предназначены для разработки ДНК-зондов, аптамеров и сомамеров, применяющихся в молекулярно-биологических исследованиях и в медицинской диагностике. 9 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 21 пр.
Изобретение относится к новым соединениям, которые могут найти применение в медицине, характеризующимся структурной формулой
или
,где R1 представляет собой -Н, -СН3; R2 представляет собой –Н, -СН2ОН, -(CH2)2S(O)CH3; R3 представляет собой -Н, pNP, NHS; n=0-5, m=1-3, М+ представляет собой Na+, Li+, K+, (C2H5)(4-y)NHy+ (где у=1,4). Предложенный способ получения указанных соединений состоит в непосредственной модификации натриевой соли соответствующего индоцианинового красителя, содержащей две сульфогруппы, путем превращения одной из сульфогрупп в положении 5 индоленинового фрагмента в карбоксиалкилсульфамидную группу. Предложены новые производные нуклеотидов, эффективные в качестве флуоресцентных меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР, а также эффективный способ их получения. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 21 пр., 2 табл., 2 ил.
Изобретение относится к области медицины. Изобретение представляет собой набор специфичных олигонуклеотидных праймеров для видовой идентификации бактерий рода Acinetobacter и определения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, включающий: 2 пары олигонуклеотидных праймеров для амлификации гена rpoB, с нуклеотидными последовательностями atgcgtccaggcgagccaccaac, gcggctgaaa acttattcaa taac, tctg aacgctatga cttatc, atggtcgtgtttgtccaattgaa; 3 пары олигонуклеотидных праймеров для амлификации генов карбапенемаз ОХА-типа (оха-51 и оха-51-like), с нуклеотидными последовательностями gcaccataaggcaaccaccaca, aagtatttaaatgggatggg, agaatgggaaaagaacatgacc, ttggacttgagctcatgtctaag, gcaccataaggcaaccacccgg, aagtatttaaatgggatgcc; 2 пары олигонуклеотидных праймеров для амлификации гена карбапенемазы оха-23, с нуклеотидными последовательностями atctggtgtttaaaatgaataa, gattcatcaatactttgatgaa, tggaagggcgagaaaaggtcat, ggcaagggatataaaaccacaa; 2 пары олигонуклеотидных праймеров для амлификации гена карбапенемазы оха-40, с нуклеотидными последовательностями tgaagctcaaacacagggtgta, taaaaaaagaacttatcctatgtg, ccagtatatcaagagcttgcaag, ccttaaaattacaccagtacaagaag. Способ идентификации бактерий Acinetobacter и определения их устойчивости к бета-лактамным антибиотикам включает выделение ДНК из проб биоматериала или бактериальных культур и проведение ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами, при этом используют предложенный набор олигонуклеотидных праймеров, и в случае обнаружения генов rpoB и оха-51 идентифицируют бактерий рода Acinetobacter, а при наличии генов оха-23 и оха-40, кодирующих карбапенемазы ОХА-23 и ОХА-40, делают вывод об устойчивости анализируемого штамма к антибактериальным препаратам бета-лактамного ряда. Изобретение позволяет идентифицировать бактерии Acinetobacter непосредственно в клиническом материале с одновременным определением устойчивости к карбапенемам ОХА-типа; а также может быть использован при выборе лекарственного препарата, режима лечения и для эпидемиологического контроля. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к флуоресцентно-меченым дезоксиуридин трифосфатам, которые могут найти применение в качестве меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР. Предложенные соединения включают в себя 5-[4-аза-5-оксо-9-(3,3',3'-триметил-1-(4-сульфонатобутил)-1'-этилиндодикарбоцианин-3-ил)-нон-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-9-(3,3',3'-триметил-1,1'-ди-(4-сульфонатобутил))индодикарбоцианин-3-ил)-нон-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-9-(3,3',3'-триметил-1'-(4-сульфонатобутил)-1-этилиндодикарбоцианин-3-ил)-нон-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-9-(3,3',3'-триметил-5'-сульфо-1,1'-диэтил-индодикарбоцианин-3-ил)-нон-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-9-(3,3',3'-триметил-1,1'-диэтил-5-сульфо-индодикарбоцианин-3-ил)-нон-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-7-(1-(4-сульфонатобутил)-3,3,3',3'-тетраметил-1'-этилиндодикарбоцианин-5-ил)-гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-7-(1'-(4-сульфонатобутил)-3,3,3',3'-тетраметил-1-этилиндодикарбоцианин-5-ил)-гепт-1-ен-1-ил)]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат, 5-[4-аза-5-оксо-7-(3,3,3',3'-тетраметил-5'-сульфо-1,1'-диэтилиндодикарбоцианин-5-ил)-гепт-1-ен-1-ил]-2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат или их соли. Предложены новые флуоресцентно-меченые нуклеотиды, эффективные в качестве флуоресцентных меток для маркирования ДНК в ходе ПЦР, в том числе с использованием известных тест-систем для определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью к М. Tuberculosis и с генетической предрасположенностью к тромбозам. 3 н.п. ф-лы, 13 ил., 4 табл., 45 пр.
Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине
Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине
Изобретение относится к области вирусологии и молекулярной биологии
