Патенты автора Тимофеев Эдуард Николаевич (RU)
Изобретение относится к области молекулярной биологии, органической химии, биотехнологии, микробиологии и медицины. Заявлен способ определения субстратной совместимости модифицированных трифосфатов дезоксиуридина и ДНК-полимераз сочетанием методом количественной ПЦР и электрофореза. Сущность изобретения заключается в том, что совместимость модифицированных нуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимераз определяется сочетанием методов: количественной ПЦР в режиме реального времени на матрице "условно двухцепочечной" ДНК, составленной из двух синтетических олигонуклеотидов с вырожденной центральной частью с взаимно комплементарными фланкирующими частями при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; количественной ПЦР в режиме реального времени на бактериальной ДНК-матрице, представляющей собой ПЦР-продукт фрагмента гена rpoB длиной 215 п.н. с амплификацией "вложенного" короткого внутреннего фрагмента длиной 126 п.н. при полной замене природного нуклеотида на модифицированный аналог; электрофоретического контроля продуктов ПЦР с количественной оценкой полноразмерного продукта. Модифицированные 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфаты содержат в своей структуре функциональные группы, которые присоединены к 5-положению пиримидинового основания карбониламиноаллильным линкером, аллильная часть линкера связана с 5-положением пиримидинового основания транс-алкеновой связью. Функциональные группы представлены линейными алифатическими, разветвленными алифатическими, фенилалкильными, алкилиндольными группами. Использовали ДНК-полимеразы с отсутствующей корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью, относящиеся к разным семействам - Taq (семейство А) и Vent(exo-) (семейство Б). Использовали ПЦР с регистрацией в реальном времени, (Real time PCR) по накоплению флуоресцентного сигнала от интеркалирующего красителя Eva Green (Biotium, США) с возбуждением флуоресценции на длине волны около 500 нм и регистрацией около 530 нм. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 4% агарозном геле. Визуализацию продуктов реакции осуществляли окрашиванием агарозного геля, в котором разделяли продукты ПРЦ, бромистым этидием. Количественную оценку полноразмерного продукта проводили по оптической плотности соответствующих полос в дорожках геля. Предлагаемое изобретение может быть использовано при получении модифицированных фрагментов ДНК и модифицированных аптамеров, функциональных аналогов моноклональных антител. Изобретение обеспечивает определение субстратной совместимости производных нуклеозидтрифосфатов и матричнозависимых ДНК-полимераз, предназначенных для получения высокоэффективных модифицированных ДНК-аптамеров методом SELEX. 7 з.п. ф-лы, 1 табл., 104 пр., 3 ил.
Настоящее изобретение относится к области органической химии, биохимии и молекулярной биологии. Описан способ получения комбинаторных ДНК-библиотек, содержащих модифицированные нуклеотиды, предназначенные для специфического связывания с молекулярными мишенями. Сущность изобретение заключается в том, что для получения комбинаторной модифицированной одноцепочечной ДНК-библиотеки используется комбинаторная одноцепочечная ДНК-библиотека из природных нуклеотидов и комплементарная модифицированная ДНК синтезируется в ходе матрично-зависимой высокоспецифичной ферментативной реакции удлинения праймера (primer extension) при полной замене одного из природных нуклеотидов на модифицированный аналог. Для реакции удлинения праймера предлагаются Deep Vent(exo-) и KOD XL ДНК-полимеразы и модифицированные трифосфаты дезоксиуридина с заместителями по С5-положению уридинового основания, которые полностью взаимосовместимы. При синтезе модифицированных ДНК используется один тип праймеров, закрепленных на поверхности полиэтилентерефталатных микрочастиц, что позволяет отделить и отмыть микрочастицы носителя с полученными закрепленными одноцепочечными модифицированными ДНК от используемой ДНК матрицы и компонентов реакции. В состав праймеров входят группы, позволяющие селективно отщепить модифицированную ДНК от носителя, не затрагивая ее функциональную часть фотохимическим или ферментативным методами, что позволяет получить комбинаторную модифицированную одноцепочечную ДНК-библиотеку в чистом виде. Кроме того, представлена соответствующая библиотека. Изобретение расширяет способы получения ДНК-библиотек. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 пр.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и обеспечивает определение субстратной совместимости свойств производных 2`-дезоксиуридин-5`-трифосфатов и матричнозависимых ДНК-полимераз. Изобретение может быть использовано при получении модифицированных фрагментов ДНК, а также при получении высокоэффективных модифицированных аптамеров методом SELEX. 8 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к реагенту на основе альфа-фетопротеина, иммобилизованного на поверхности твердых микрочастиц полиэтилентерефталата (ПЭТ-микрочастицы), а также к способу сайт-специфичной ковалентной иммобилизации альфа-фетопротеина на поверхности функционализованных ПЭТ-микрочастиц за гликозидный фрагмент белка. 2 н.п. ф-лы, 11 пр., 1 ил.
Изобретение относится к области молекулярной биологии, энзимологии, биотехнологии и медицины и предназначено для получения ДНК-аптамеров. Способ включает: (а) предварительное обогащение комбинаторной ДНК-библиотеки путем образования ее комплекса с иммобилизованной белковой мишенью (альфа-фетопротеин человека; АФП) и проведения раундов селекции; (б) образование комплекса полученной библиотеки с раствором нативного (неиммобилизованного) АФП; (в) отделение комплексов ДНК/АФП от несвязавшихся ДНК-олигонуклеотидов методом акриламидного электрофореза; (г) экстракцию связавшейся с АФП ДНК из акриламидного геля при 37°С; (д) термическую диссоциацию оставшейся в виде комплекса с АФП ДНК из геля при 60°С; (е) амплификацию ДНК после термической диссоциации. После проведения раундов селекции с использованием термической диссоциации получают обогащенную ДНК-библиотеку, пригодную для секвенирования. Использование термической диссоциации, благодаря созданию более жестких условий отмывки связавшихся с мишенью ДНК-олигонуклеотидов, позволяет повысить эффективность отбора наиболее специфичных аптамеров к белковым мишеням. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 10 пр.
Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения гетерогенного набора одноцепочечных фрагментов ДНК для мультиплексного генетического анализа. Сущность изобретения заключается в проведении мультиплексной твердофазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полисахаридном носителе и последующем отщеплении одной из синтезированных цепей для целей анализа на олигонуклеотидном микрочипе. Мультиплексный характер твердофазной амплификации достигается за счет использования смеси частиц полисахаридного носителя, на каждой из которых иммобилизована индивидуальная пара праймеров для амплификации. Один из праймеров в каждой паре иммобилизованных праймеров содержит отщепляемую группу. Для введения репортерных групп в ДНК-цепь в ходе проведения ПЦР в реакционную смесь добавляется флуоресцентно меченый нуклеозидтрифосфат. Изобретение позволяет проводить параллельный генетический анализ. 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.
Настоящее изобретение относится к миметикам ПАР и способу их получения для создания новых медицинских препаратов общей формулы
где Y - остаток нуклеозида, аминопроизводного алифатического соединения, флуоресцентного красителя; Z - остаток нуклеозида, (k+1)·m=1-200; X является О или S; R1 и R2 являются остатком дисахаридного нуклеозида или остаток формул
где n=2-6; 2-6 или 1-4 соответственно, N=остаток нуклеозида, или -((CH2)nO)m-(P=X(OH))O-N-, где n=2-6, m=1-6, R3 представляет собой разветвитель формулы
где N′- остаток дисахаридного нуклеозида, n число до 100, или остаток формул
n=2-6; или n=2-6; или n=1-4
где В=аденин-9-ил, урацил-1-ил, цитозин-1-ил или гуанин-9-ил. Предложены новые миметики ПАР, сохраняющие все основные функциональные группы и расстояния между ними, необходимые для взаимодействий с белками, но модифицированные для облегчения их синтеза и увеличения стабильности. 2 н.п. ф-лы, 21 пр., 2 табл., 10 ил.
Изобретение относится к новым ингибиторам поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека на основе производных урацила общей формулы (I), (II), (III) и (IV). Ингибиторы поли(АDР-рибозо)полимераз-ферментов участвуют в репарации ДНК. В общей формуле (I), (II), (III) и (IV)
R1=Н, Cl, Br, I, метил, этил, пропил или изопропил; R2, R3, R4, R5=Н, метил, этил, пропил или фенил; R6=(СН2)n, где n=1-4; X=OR2 или NR2R3, R2, R3=Н, метил, этил, пропил, фенил, 3-гидроксипропил. 1 табл., 19 пр.
Изобретение относится к области молекулярной диагностики, молекулярной биологии, вирусологии и биоорганической химии
