Способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз. Советских

Социалистических

Республик

<щ1004469 ф

"-г (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 30.04.81 (21) 3282348/28-13, с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 150333, Бюллетень ¹1p ($g)+ Кд 3

С 12 и 1/00

//С 12 (} 1/06

Государстяенный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (И) УДК 663.18 (088.8) Дата опубликования описания 15.p3.83

Э.Г. ТутОВа, Э.В. ИВаШКЕВИЧ, Ю.Н. ТИМОНЬКИВк.

P.Ñ. Сабрекова, М.П. Вншникина, О.Е. Григорьянц и Т.Э. Фруман

Ордена Трудового Красного Знамени институт :: тепло-,и массообмена им. A.Â. Лыкова„:

AH Белорусской ССР -" -::. :.:д" » :,-, (72) Авторы изобретений (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ

ЖИЗНЕСПОСОБНЫК КЛЕТОК МИКРОБНОЙ

БИОМАССЫ

Т= (а+Ь ° l л 11) 10, Изобретение относится к микробиологической промьхаленности, в частности к способам определения концентрации жизнеспособных клеток микроорганизмов.

Известен способ определения концентрации жизнеспособных клеток путем рассева на питательные среды 1 1). Ближайшим к изобретению техни.ческим решением по технической сущ,ности и достигаемому эффекту является способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы в процессе культивирования микроорЁайиэмов на питательной среде f2T.

Недостатком известного способа является его продолжительность (114 суток) и низкая точность анализа (не менее +30%).

Цель изобретения - ускорение спо,соба н повьхаение его. точности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации жизнеспособных клеток мнк робиой биомассы в процессе культиви» рования микроорганизмов на питательной среде измеряют вязкость полученной биомассы при температуре культи вирования микроорганизмов, а концент-. рацию жизнеспособных клеток определяют по формуле

5 где Т - концентрация жизнеспособных клеток, мг, 0 - кинематическая вязкость

10 - биомассы, сСт, а,Ь - эмпирические коэффициенты, определяемые природой биомассы.

Прн этом перед измерением вязкос ти биоМассу фильтруют.

Сущность предлагаемого способа определения концентрациИ жизнеспособных клеток состоит в том, что для ряда микробных культур (спорообразующая культура Васi11ия dendrolim us Вас °

thuring lensis, вегетативная культура

Rh1zo1ium p.isum) экспериментально установлена взаимосвязь межцу вязкостью биомассы и количеством жизнеспособных клеток в единице объема (титром) в виде

Т(а+Ь" lп.я)10, 9 (1) где Т - титр (концентрация микроб30 ных клеток) кл/мп;

1004469

13

r.k

980,7 (2) где - время, с;

g — ускорение силы тяжести = 981 см/с, k - постоянная вискозиметра.

Расчет среднего значения вязкости исследуемой жидкости производят на основании 5-7 измерений .

Параллельно измерению вязкости проводят микробиологический анализ образца исследуемой жидкости с целью определения титра (кл/мп) по стандартной методике методом последовательных разведений с высевом на твердую питательную среду.

В результате статистической обработ ки экспериментальных данных получают аналитическую зависимость титра исследуемой биомассы от вязкости (1).

На чертеже приведена зависимость титра исследуемой биомассы от вяз кости

М - кинематическая вязкость б омассы, сСт; а,Ь- эмпирические коэффициенты, определяемые природой биомассы.

Проводят измерение вязкости биомассы капиллярным вискОзиметром, диаметр которого выбирают с учетом природы исследуемой жидкости. При наличии в жидкости остатков питательных сред жидкости фильтруют через фильтр с размером ячеек, не пре. вышающим диаметр капилляра вискоэиМетра, во избежание засорения капилляра вискозиметра. Заполненный жидкостью вискоэиметр термостатируют в устройстве, обеспечивающем визуальное наблюдение истечения жидкости через капилляр при температуре не выше температуры культивирования биомассы (28-30 С) и через

10-15 мин проводят измерение времени истечения жидкости через капилляр при помощи секундомера. Расчет вязкости производят по формуле (Паспорт к вискознметру ВПЖ)", Прямая линия, построенная на основании этой зависимости, является калибровочным графиком для определения титра биомассы (чертеж).

Пример 1. В лабораторных условиях измеряют зависимость вязкости от концентрации жизнеспособных клеток (титра.) культуральной жидкости Baciiius thuringiensis штамм 5072 и суспензии клеток того же штамма.

Опыты проводят на капиллярном вискозиметре ВПЖ-1. (К=О,ОЗОЗЗ) при постоянной температуре 20© С с диаметром капилляра 0,86.

Необходимости в фильтровании жидкости нет.

Заполненный жидкостью вискозиметр помещают в термостатирунхаее устройство, обеспечивающее визуальное наблюдение истечения жидкости через капилляр, выдерживают 15 мин и проводят измерение времени истечения жидкости через капилляр вискозиметра. Затем по формуле (2) рассчитывают вязкость исследуемой жидкости.

Первым этапом исследования явля10 ется построение калибровочного графика Т f(4 ). Титр суспензии клеток и культуральной жидкости определяют по стандартной методике. Титр находится в пределах (0-2) -10 кл/мп, величина вязкости при этом изменяетI ся в пределах 1-1,8 сСт.При статистической обработке полученных данны3Г устанавливают зависимость Т - Г(4 ) в виде (1) с коэффициентами а =-3 и

2g Ь =+10, что соответствует на графи1 е (чертеж/ участку 1. Затем по этой ривой определяют титр образца культуральной жидкости, для которой по-, лучают С = 48,5 с и 4 = 1,47 сСт.

2 Значение титра из калибровочного графика Т = 1,1 -109 кл/мл.

Пример 2. Определяют изменение культуральной жидкости (биомассы) культуры Вас. dendro1imus от

Зо

Испытывают около 50 образцов культуральной жидкости штамма 49-8 на капиллярном вискозиметре ВПЖ-1 с диаметром капилляра 0,86 мм (K=

=О, 02743) при температуре среды 30 С.

Для этого 40 мл образца жидкости фнльтруют через фильтр с размерами ячеек 0,7-0,8 мм и заливают в вискозиметр. Заполненный исследуемой жидкостью вискоэиметр устанавлива40 ют в термостатирующее .устройство, аналогичное примеру 1, и выдерживают 15 мин. Затем при помощи секундо мера замеряют время истечения жидкости через капилляр и по формуле (2)

45 рассчитывают вязкость. Расчет среднего значения вязкости производят на основании данных 5-7 измерений иссле дуемого образца жидкости.

Строят калибровочный график. Для

® этого параллельно измерению вязкости проводят микробиологический анализ образцов по стандартной методике, аналогично примеру 1. Затем после .статистической обработки экспериментальных данных в диапазоне вязкости

2-3 сСт и титра 2-6-10 кл/мл получают зависимость (1) с теми же, что и s примере 1,коэффициентами а=-3 и Ь = 10 (чертеж, участок Й ). Полу40 ченный график служит для определения титра образцов культуральной жидкости. Так, для образца культуральной жидкости получают Г = 88,2 с, 9 =

2,42 сСт. Из графика находят Т=5,3

10 кл/мп.

1004469

Формула изобретения га

Пример 3. Определяют изменение вязкости пасты (биомассы) культуры Вас. thuringlens1s штамм 844 от титра. Паста. получается при концентрировании культуральной жидкости путем сепарации и отличается от культураль- 5 . ной жидкости меньшей влажностью и, соответственно, значительно большей концентрацией биомассы.

Испытывается около 30 образцов пасты на капиллярном висказиметре

ВПЖ-2 с диаметром капилляра 1,31 мм (K = 0,3399) при температуре среды

30 С. Йетодика измерения вязкости (фильтрация пасты, заливка вискоэиметра,. термостатирование, измерение 15 времени, расчет вязкости) аналогично примеру 2, Микробиологический анализ образцов по стандартной методике проводят анапогично примерам 1 и 2.

Калибровочный график строится 2р после статистической обработки экспериментальных данных (диапазон вязкос" ти 3-27 сСт, титра — (6-30):10 кл/мп) в виде зависимости (1) (чертел4, учас гок lit).с такими we коэффициентами, 25 как и для участков и 11 прямой.

Полученная кривая служит для определения титра образцов пасты. Так, для. образца пасты получают ф = 66,2 с, 22,5 сСт. Из графика находят

Т = 28,3 ° 10 9 кл/мп.

" Таким образом, преимуществами предлагаемого способа по сравнению с известным являются: сокращение времени определения титра микробной. биомассы (15-20 мин), что позволяет в производственных условиях использовать способ в качестве экспрессконтроля и как минимум в 2 раза повысить точность контроля.

Способ определения концентрации жизнеспособных клеток микробной биомассы. в процессе культивирования микроорганизмов на питательной среде, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения его точности, измеряют вяз кость-полученной биомассы, при. температуре культивирования микроорганизмов, а концентрацию жизнеспособных клеток определяют по формуле

t-(а+Ьам)Ю9 . где Т вЂ” концентрация жизнеспособных клеток, мп, - кинематическая вязкость биомассы, сСт, ОЬ- эмпирические коэффициенты, определяемые природой биомассы.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что перед измерением вязкости биомассу фильтруют.

Источники информации, ;принятые во внимание при экспертизе

1. Задания к практическим занятиям по микробиологии. Л., ЛГУ,.1974.

2. Вольшой практикум ао микробиологии. Под ред. проф. Г.Л. Селибера.

M., "Высшая школа", 1962.

ВНИИПИ Заказ 1801/35

Тираж 521 Подписное

clan

Филиал ППП "Патент", r Ужгород,ул.Проектная,4