Способ очистки культур кокцидий
СПОСОБ ОЧИСТКИ КУЛЬТУР КОКЦИДИЙ, включающий флотацию в насыщенном растворе хлористого натрия и дифференциальное центрифугирование , отличающий ся тем, что, с.целью повьшюния качества очистки, дифференциальное центрифугирование проврдят в градиенте плотности сахарозы 1,0501 ,086 г/см с дальнейшим пропуска;нием через ионообменные смолы с размером частиц 0,3-2 мм. СП
„„SU„„1006484 A
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИН з(11 С 12 и 1/00; С 12 И 3/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ГО делАм изОБРетений и ОтнРытий
OllHGAHNE ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3275115/30-15 (22) 02.02.81 (46) 23. 03. 83. Бюл. 9 11 (72) М.А. Мусаев, Я.Я. Елчиев и Т.В. Ребрикова (71) Зоологический институт AH
Азербайджанской ССР (53) 616.993.192.1:621.7.022/.027 (088.8) (56) 1. 5а1сй Й.R. Ruff И.0. А rapid
technique for cleani.pg and -concentration of E. cocysts. — nPoultry Sci", 19.75, 54, б, р.2081-2086.
2. Перов М.Ф., Тальдрик A.A.
Аминокислотный состав белков ооцист некоторых видов кокцидий кур.—
:ЧТаразитология", т. 9, У б, 1975, с. 535-539.. (54) (57) СПОСОБ ОЧИСТКИ КУЛЬТУР
КОКЦИДИЙ, включающий флотацию в насыщенном растворе хлористого натрия и дифференциальное центрифуги.рование, отличающийся тем, что, с целью повышения качества очистки, дифференциальное центрифугирование проводят в градиен.те плотности сахарозы 1 0503
1,086 г/см с дальнейшим пропусканием через ионообменные смолы с размером частиц 0,3-2 мм.
1006484
Изобретение относится к зоологии и паразитологии, в частности к способам очистки кокцидий.
Известен способ очистки и концентрирования кокцидий путем высаливания и центрифугирования (1 j. 5
Недостатком этого способа является недостаточно полная очистка кокцидий..
Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки кок- 1Î цидий с применением флотации и дифференциального центрифугирования Г23.
Однако такая очистка не позволяет получить чистую биомассу культуры кокцидий, пригодную для биохими.ческих и иммунологических исследований.
Целью изобретения является повышение качества очистки.
Указанная цель достигается тем, что дифференциальное центрифугирование проводят в градиенте плотности сахарозы 1,050-1,086 г/см с дальнейшим пропусканием через ионообменные смоли с размером частиц .
0,3-2 мм. !
- Путем введения в зоб цыпЛенка одной ооцисты нужного вида кокцидий получают культуру. Стерильных по отношению кокцидий цыплят 10-20-днев- 30 ного возраста заражают ооцистами кокцидий в дозе 5000 на одну птицу и нерез 5-8 дней после заражения, т.е. в первые трое суток латентного периода, собирают их помет. Собран- 35 ный помет тщательно раэмельчают, разводят водопроводной водой в соотношении 1:3 и пропускают через 4 слоя марли. Суспензию разливают по 50 мл в центрифужРые пробирки и центрифугируют 5 мин при
3000 об/мин. Верхний слой отбрасывают. Операцию повторяют дважды. К осадку добавляют насыщенный раствор .хлористого натрия плотностью 1,201,24 г/cM, тщательно размешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.
Эту операцию повторяют до тех пор, пока все ооцисты не поднимутся из осадка. Суспензию ооцист с насыщенным раствором хлористого натрия разбавляют дистиллированной водой 1:10 (плотностью 1,01-1,02 г/см ) и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.
Надосадочную жидкость выбрасывают.
К осадку добавляют дистиллированную воду и центрифугируют. Процедуру повторяют до полного удаления хлористого натрия. Осадок с ооцистами разбавляют раствором сахароэы плотностью- 1,050-1,086 г/см и центрифуги- 60 руют 15 мин при 1000 об/мин. Суспензию ооцист в сахарозе собирают в стаканы и разбавляют водой 1:10.
Центрифугированный осадок вновь разбавляют раствором сахарозы плотностью6
1,050-1,086 г/см З и очистку с саха-. розой повторяют еще два. раза.
Оптимальные результаты при очищении ооцист от посторонних примесей достигают при плотности сахарозы
1,050-1,0,86 г/см . Повышение плотности сахарозы до 1,500 г/см 3 и, далее приводит к увеличению вязкости раствора, прилипанию посторонних примесей к ооцистам и всплыванию их в супернатант, что ухудшает качество очистки. При понижении плотности сахарозы (до 1 г/смЗ и далее) уменьшается выход ооцист вследствие.осаждения их на дне центрифужной пробирки.
В конечном итоге осадок с ооцистами разбавляют дистиллированной водой 1:10 и пропускают через стеклянный фильтр Р 2, соединенный водоструйным насосом. Оставшиеся на фильтре ооцисты промывают дистиллированной водой и раствором пенициллина 400 единиц на 1 л воды. Затем ооцисты смывают стерильной дистиллированной водой в чистую стерильную посуду. Полученный фильтрат переносят в стаканы с катионитом КУ-1 (размер частиц 0,3-2 мм), взбалтывают и оставляют на 3 мин (ионнообменные смолы оседают быстрее, чем ооцисты кокцидий). Жидкость отсасывают и переносят в стаканы с анионитом AH-1 (размер частиц 0,32-2 мм). Взбалтывают и оставляют также на 3 мин.
Обработку суспензии с ионитами повторяют еще два раза для полного удаления химических примесей ° Собранную суспенэию переносят в стериль-. ные делительные"воронки. После осаждения ооцист отсасывают излишек воды.
Для подтверждения чистоты культуры таким же образом обрабатывают фекалии от контрольных незараженных птиц. Чистоту жидкости, полученной из фекалий контрольных незараженных
Птиц, проверяют под микроскопом и с ней ставят качественную биуретовую реакцию на белки. При контрольной обработке предложенным способом фекалий от птиц без кокцидий в конечном этапе очистки собранный супернатант показал отрицательную биуретовую реакцию на .белки при 10-кратном повторении, тогда как обработI ка фекальной массы по известным способам во всех случаях выявила положительную биуретовую реакцию на этот показатель.
Ионнообменные смолы перед употреблением просеивают, удаляют мелкие частицы и оставляют для набухания в дистиллированной воде. Выбирают ионнообменные смолы с частицами размером 0,3-2 мм, что дает сравнительно быструю оседаемость ионнообменника, по сравнению с ооцистами
1006484
Составитель Т. Чечеватова
Редактор Г. Безвершенко Техред С.Мигунова
Корректор E. Рошко
Подписное
Заказ 2052/41 Тираж 521
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35,, Раушская наб., д; 4/5
Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Проектная, 4
I кокцидий. При применении ноннообменных смол с размерами частиц меньше
0,3 мм удлиняется время оседания ионнообменника, что приводит к оседанию определенного количества ооцист вместе со смолой. 5
Иониты с размерами частиц свыше
2 мм использовать невыгодно, посколь- . ку они быстро насыщаются и неэкономно расходуются. 10
Круг веществ, которые могут быть использованы при хроматографии, orраничивается ионнообменными смолами с размерами частиц 0,3-2 мм.
После очистки культур кокцидий изучали их аминокислотный состав на аминокислотном анализаторе (ААА-881, Чехословакия). При этом данные но количеству отдельных аминокислот, входящих в состав кокцндий Е. tenella, отличались от данных которые по- . лучены при применении известного метода.
Выход ооцист составляет 35-40% исходного их количества.
