Штамм актиномицетов @ @ @ 8-2-продуцент тромболитических ферментов,специфичных к фибрину

 

Штам актиномицетов Actinomyces spheroides М8-2 (Коллекция Центрального музея промышленных культур микроорганизмов ВНИИгеиетика, коллекционный номер ЦМПМ S-573) продуцент тромболитических ферментов, специфичных к фибрину

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1 ..

H АВТОРСКОМV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HOMHTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3307787/28-13 (22) 13.05 ° 81 (46) 07 ° 04.83 ° Бюл. Ю 13 (72) Н.И. Ирянишникова, М.А. Аль-Нури и Н.С. Егоров (71) Московский ордена Ленина, ордена

Октябрьской Революции и ордена Трудового. Красного Знамени государственный университет им. М.В. Ломоносова (53) 577.15(088,8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке Н 3290294/28-13, кл. С 12 М 9/68, 1980, 2. Авторское свидетельство СССР

N 565936 кл. С 12 N 9/68, 1977.

„„SU„„>010f27 A (50 С 12 и 15/00; С 12 и 68 (54) ШТАММАКТИНОМИЦЕТОВ ACTINOMYCES SPHER0tDES М8-2 " ПРОДУЦЕНТ ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К

ФИБРИНУ. (57) Штам актиномицетов Actinomyces

sphегоides М8-2 (Коллекция Центрального музея промышленных культур микроорганизмов "ВНИИгенетика", коллекцион" ный номер ЦМПМ S-573) - продуцент тромболитических Ферментов, специфичных к Фибрину.

1 1010

Изобретение относится к микробиологическому производству фибринолити ческих ферментов и представляет собой новый штамм актиномицетов рода Acti nomyces, используемый для получения ферментов> гидролизующих фибрин и тромбы крови человека и являющихся перспективным при лечении тромбо-змболических осложнений при сердечнососудистых заболеваниях. Изобретение 16 может быть применено в микробиологии, медицине и медицинской промышленности.

Известен способ получения тромболитических ферментов, специфичных к фибрину, предусматривающий совместное культивирование микроорганизма-продуцента Nocardia species, шт. 1 и микроорганизма-стимулятора Arthrobacter

citreus, шт. 6-654, При культивировании микроорганизмов в течение 72 ч фибринолитическая активность составляет 3456 условных ед./мл, специфичность к фибрину 241,7 время растворения тромба 1,5 ч 1 j.

Наиболее близким к предлагаемой по технической сущности является штамм актиномицетов Actinomyces thermovuIgaris Т-54 - продуцент фибри олитического фермента $2 ).

ЗО

Недостатками зтого штамма являются низкая активность фибринолитических ферментов в культуральной жидкости при выращивании на синтетических средах (1/00 ед/мл), низкая активность фибринолитических ферментов в препаратах, низкая тромболитическая актирность.

Целью изобретения является получение штамма рода Actimonyces — продуцента тромболитических ферментов, специфичных к фибрину с высокой тромболитической и фибринолитической активностью.

Предлагаемый штамм получен путем многоступенчатой селекции с примененисм мутагенных факторов из исходного штамма Actimomyces sphегоides 35.

Полученный штамм имеет следующие морфологичесн:ие и физиологические ха- 5 рактеристики.

Морфологические характеристики.

Штамм имеет короткие спиральные спороносцы с 1-2 неплотно сжатыми завитками. Споры свальные с гладкой по- 55 верхностью.

На средах штамм имеет следующие культуральные признаки,,1 27

Среда Чапека с глюкозой. Рост хороший, воздушный. мицелий белый, белопалевый. Субстратный мицелий светложелтый, светло-коричневый. Среда не окрашена.

Овсяный агар, Рост хороший, воздушный мицелий бело-палевый, Субстратный мицелий зеленовато-коричневый.

Среда не окрашена.

Мясопептонный агар. Рост плохой, воздушный мицелий скудный, беловато серо-палевый. Среда не окрашена.

Крахмальный агар с неорганическими солями. Рост хороший, воздушный мицелий палевый, бела-палевый, Субстратный мицелий желто-коричневый. Среда не окрашена.

Аспарагиновый агар с глицерином.

Рост хороший, воздушный мицелий белопалевый„ темно-палевый. Субстратный мицелий желто-коричневый, Среда не окрашена.

Пептонный агар с дрожжевым зкстрактом и железом. Рост хороший, воздушный мицелий белый, бело-палевый. Субстратный мицелий желто-коричневый, светло-желтый. Среда не окрашена, Агар с тирозином, Рост хороший, воздушный мицелий белопалевый. Субстратный мицелий светло-коричневый, коричневый. Среда не окрашена.

Штамм относится к Actimomyces sphегоides и к Streptomyces sphегоides.

Штамм образует в основном внеклеточный фермент, что значительно облегчает его выделение. Высокая продуктивность штамма стабильна при длительном хранении культуры на фибриновом агаре, содержащем, г/л: фибрин 5-10; однозамещенный фосфат калия 1-3; сернокислый магний 4-6; сернокислый цинк

0,005-0,01„ сернокислое железо 0,0150.02; агар 10-20, при комнатной температуре в виде спор.

При глубинном культивировании на соевой среде рост штамма в виде гомогенной массы, На синтетической среде, содержащей, г/л: глюкозу 70; цитрат натрия 4,8; сернокислый магний 5,75; сернокислый аммоний l,25; однозамещенный фосфат калия 2,0; сернокислый цинк 0,01; сернокислое железо

0,02, рост штамма в виде гомогенной массы или мелких шариков, Культуральная жидкость, отделенная от мицелия имеет коричневую окраску и характерный запах. физиолого-биохимические признаки.

3 10101

Оптимальная температура роста 26"

28 С.

Отношение к углевбдам. Хорошо усваивает глюкозу, ксилозу, фруктозу, арабинозу. Не усваивает сахарозу, рафинозу, рамнозу.

Отношение к спиртам. Усваивает маннит инозит °

Разжижает желатину, молоко пептонизирует без свертывания, крахмал не. 10

) фибринолитическая активность

Штамм

Синтетическая среда

Культуральная Препарат, усл.ед./г жидкость, усл. ед./мл

3500-4000

10500-11000

1900

3500-5500

?000-2500

700

Как видно из таблицы штамм Actinomyces sphегоides M8-? отличается от известного и исходного штаммов высокой фибринолитическбй активностью.

35 фибринолитическую активность определяют методом Astrup. Mullertz, Продолжительность инкубации пластинок фибрина ч 38 С. Тромболитическую активность определяют методом Броц4О кой C.З. и Имшенецкого А.А. по скорости лизиса тромба in vitro. Культуральная жидкость Actinomyces sphегоides

»8-2 растворяет тромбы крови за

30 мин 10 мкг препарата растворяет тромб за 1 ч. Величина казеинолитической активности в культуральной жидкости составляет 450-500 ПЕ/мл и 500600 ПЕ/мг препарата. Казеинолитическую активность определяют методом

Ансона. 50

Пример 1 . Актиномицет Actinomyces sphегоides И8-2 выращивают на скошенной агазированной среде, содержащей> г/л: фибрин 1О; однозамещенный M фосфат калия 3; сернокислый магний 6; сернокислый цинк 0,01; сернокислое железо 0,02; агар 20, при 28 С в теПредлагаемый (Act1nomyces

sphегоides M8-2) Известный (Actinom. thermo.vulgaris N-55) Исходный (Actinomyces sphегоides 35) 27 ф гидролизует. Гидролизует фибрин, фибриноген, плазму. Тирозиназа отрицательная, меланоизов не образует, нитраты восстанавливает, на клетчатке не растет. Образует антибиотик новобиоцин.

В таблице дана фибринолитическая ак. тивность фермента в культуральной жидкости и фибринолитическая активность препаратов предлагаемого, известного и исходного штаммов. чение 5 дней. Затем культуру актиномицета с одной пробирки переносят в

200 мл известной питательной среды, содержащей, г/л: соевую муку 20; сернокислый аммоний 3; хлористый натрий 2,5; однозамещенный фосфат калия 0,75; углекислый кальций 3;для выращивания посевного материала.

Посевной материал выращивают на качалках (180-200 об/мин ) в колбах емкостью 750 мл с 200 мл среды в каждой в течение 72 ч при 28 С. Затем посевной материал в количестве 53 вносят в синтетическую среду известного состава, содержащую, г/л: глюкозу 70; цитрат натрия 4,8; сернокислый магний 5,75; сернокислый аммоний l 25; однозамещенный фосфат калия

2,0; сернокислый цинк 0,01; сернокислое железо 0,02, и выращивают тем же способом в течение 3 сут при 28 С .

По истечении указанного времени куль" туральная жидкость содержит 400 усл. ед/мл и 450-500 ПЕ/мл. Время растворения тромба 30 мин.

Культуральная жидкость отделяется от мицелия при помощи бумажных фильт" ров. Фибринолитический препарат осаж% 1010127 6 дают иэ Фильтрата сернокислым аммо- 1100 усл, ед./мг препарата и удельной нием при насмцении 0,6-0,8. Полу- каэеинолитическай активностью 00ченный препарат обладает удельной 600 ПЕ/мг препарата. 10 мкг препарата

Фибринолитической активностью 10 00- растворяет. тромб за 1 ч.

Составитель. Е. Воробьева

Редактоц И. Петрова Техред 0.Неце Корректор;И, Шароши

Заказ 2405/13 Тираж Я1 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 ДОЯ Москва Й-3g Раушская наб. g. 4Q

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,