Способ одновременного определения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот

Авторы патента:

C12Q1G01N33/48 -

1. СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ОБ|5 ---- in ). МЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий ферментативную обработку субстрата - нуклеозйд-5 -фосфата исследуемой пробой и хроматографическйе разделение продуктов реакций с последующей их идентификацией и качественной оценкой определяемых ферментов, о т л ичающийся тем, что. с цепью упрощения процесса и расширения диапазона определяемых фермен1юв, разделение продуктов реакций осуществляют тонкослойной хроматографией в системе растворителей диоксан; изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 И ацетат аммония, взятых в соотношении 30:18: «9:3. 2, Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют нуклео.зид-5 -моно-, диили трифосфаты. 3. Способ по пп. 1и2, отличающийся тем, что в качестве исследуемой пробы используют экстракт Ш1И ферментный препарат из Escherichia соП.

„„SU „„1013475

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИ 3 ЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬЗТИЙ (21) 3350457/28-13 (22) 23. 07. 81 (46) 23.04.83. Бюл. NÃ 15 (72) В.И.Пупкова и Г.И.Распопина (71) Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ Гла вмикробиопрома С CCP (53) 577.15(088.8) (56) 1. Nestle М., Roberts И., G.

Biol. Chem. 1969 244, р. 5219.

2. Ч.А..Schramm, F.À.Fuliiп, G.

Biol. Chem., 1978, Ч. 253, р. 2161.

3. Карlап N.Î. Methods Enzymol

1955 V. 2, р. 473.

4. Bimal С., Paletal ° "Sepation

of Bases, Ribonucleosides and 0eoxyг1Ьопис!еоз10ез by Anion-Exclusion

and Partition Chromatography on

Cation. Exchauge Resin. Application

fo the Assay of Ribonucleotide Reductase, 0eaninase and Nuc3eosidasd .

Anal. Biochem, 1975, V. 67, р. 625. (54) (57) 1. СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА ФЕРМЕНТОВ ОБэ< C 12 1 00: G 01 N 33/48

МЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий ферментативную обработку субстратануклеозид-5 -фосфата исследуемой пробой и хроматографическое разделение продуктов реакций с последующей их идентификацией» и качественной оценкой определяемых ферментов, о т л ич а ю щ и "ся тем,,что с целью упрощения процесса и расширения диапазона определяемых ферменъов, разделение продуктов реакций осуществляют тонкослойной хроматографией в системе растворителей диоксан;- изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 И ацетат аммония, взятых -в соотношении 30:18:

49:3.

2. Способ по и. 1, а т л и ч а " ю шийся тем, что в качестве субстрата используют нуклеозид-.5» -моно-, ди- или трифосфаты.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что s качестве исследуемой пробы используют экстракт или ферментный препарат из Escherichia coli. виий ©4 ф» Ql

1013475

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для комплексного качественного определения ферментов обмена нуклеиновых кислот.

Известны способы определения Ферментов обмена нуклеиновых кислот в отдельности.

Так, известен способ определения

5 -нуклеотидазы, который основан на измерении паранитрофенола, образующегося из паранитрофенилфосфата под действием 5-.-нуклеотидазы t 1 ). l0

Известен способ определения нукле15

20 озидазы, который основан на измерении рибозы, образующейся из нуклеозида под действием нуклеозидазы (2 ).

Известен способ тестирования дезаминазы, который основан на определении. изменения оптической плотности реа кционной смеси при 265 нм (31

Основным недостатком указанных способов является ограниченность их применения, поскольку данные способы применимы для определения только одного вида фермента. Кроме этого, эти способы не унифицированы и недостаточно специфичны, Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к изобретению является способ одновременного определения комплекса

30 ферментов обмена нуклеиновых кислот, в частности трех ферментов: рибонуклеотидредуктазы, дезаминазы и нук- З5 леозидазы, который заключается в обработке исследуемой пробой, содержащей определяемые ферменты, субстрата, в качестве которого используют меченый тритием цитидин ди- или трифосфат, гидролизе образовавшихся нуклеотидов в нуклеозиды при добавлении картофельной апиразы и щелочной фосфатазы и хроматографическом разделении продуктов реакций на катионообменной смоле аминекс А-6 при 50 С

40 и под давлением с последующей их идентификацией и качественной оценкой определяемых Ферментов. Продукты действия указанных ферментов - основа50 ния и нуклеозиды разделяются за 50 мин.

Наличие и наименование ферментов определяют по месту выхода элюированных продуктов на хроматограмме (4 )

Недостатками известного способа

55 являются пригодность известного способа для определения только трех ферментов, т.е. недостаточно широкий диапазон определяемых ферментов, а также сложность процесса, заключающаяся в: использовании хроматографии под давлением; применении сложного и дорогостоящего оборудования (хроматографа под давлением, сцинтилляционного счетчика, применении труднодоступной смолы аминекс А-6, использовании для определения целевых ферментов - дополнительных Ферментов апиразы и щелочной Фосфатазы и т.д.

При отработке технологических процессов выделения различных ферментов (например, полинуклеотидфосфорилазы из Е.coii) необходимо быстро и точно определять наличие примесных (сопутствующих) ферментов в грубом экстракте биомассы и по стадиям очистки, чтобы вводить стадии, селективно удаляющие примесные ферменты. При выделении ферментов по отработанной технологии необходимо следить за качеством ферментных препаратов на стадиях выделения и эффективностью очистки целевого фермента от примесных.

Одновременное определение нескольких ферментов, содержащихся в препарате, известными способами невозможно, а каждого в отдельности - занимает много времени, к тому we при совместном присутствии нескольких Ферментов эти способы становятся недостаточно .специфичными и не позволяют получать правильные результаты. Все это ставит задачу разработки достаточно простого и более универсального способа, позволяющего определять большее количество ферментов.

Целью изобретения является упрощение способа и расширение диапазона определяемых ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу одновременного определения комплекса ферментов обмена нуклеиновых кислот, включающему ферментативную обработку субстратануклеозид-5 -фосфата исследуемой пробой и хроматографическое разделение продуктов реакций с последующей их идентификацией и качественной оценкой определяемых ферментов, разделение продуктов реакций осуществляют .тонкослойной хроматографией в систе. ме растворителей диоксан: изопропиловый спирт: 5 М аммиак: 1 М ацетат аммония, взятых в соотношении 30:18:

49:3.

При этом в качестве субстрата обыч. но используют нуклеозид-5 -моно-> ди-! или трифосфаты.

3 -101

В качестве исследуемой пробы обычно используют экстракт или ферментный препарат из ЕзсЬег1с61а со11, Благодаря возможностям системы, выбранной для хроматографического разделения компонентов нуклеиновых кислот, которая позволяет разделять до 10 компонентов,,набор определяемых ферментов более широк, чем в из3475 ф вестном способе. При этом сам способ является более простым.

Сущность способа заключается в следующем.

Под действием указанных в заявке ферментов субстрат (например, АДФ) претерпевает ряд последовательных о превращений по схеме:

30 аза

Указанная цепочка взаимопревращений пра кти чес ки все гда я вля ется полной, а иногда и длиннее указанной, так как даже в высокоочищенных препаратах ферментов обычно содержится набор примесных ферментов.

Способ осуществляется следующим образом.

В реакционную смесь, содержащую субстрат, добавляют ферментный препарат и инкубируют смесь 20 мин при

37 С. За время йнкубацци исходный субстрат, например аденозин-5 -дифосфорная кислота (АДФ ), претерпева ет ряд последовательных превращений под действием соответствующих ферментов таким образом, что продукт реакции одного из ферментов является субстратом для другого и т.д.

После инкубации реакционную смесь наносят на пластину Силуфол УФ-254 и проводят хроматографию в системе растворителей диоксан - изопропиловый спирт - 5 M аммиак - 1 И ацетат аммония при соотношении последних

30:18:49:3. После хроматографии пластины просматривают в Уф-свете, фик- . сируют контуры пятен, измеряют Rf каждого пятна,. идентифицируют продук" ты реакции, и по ним качественно определяют наличие тех или иных ферментов.

Пример. При выделении полинуклеотидфосфорилазы из биомассы

Е.coli определяют наличие полинуклеотидфосфорилазы и примесных ферментов в грубом экстракте, на стадиях выделения фермента и в готовом продукте. Процедура анализа совершенно одинакова для всех стадий технологического процесса и заключается. в следую" щем: к 0,2 мл реакционной смеси, содержащей 0,025 И АДФ в 0,3 И буферном растворе трис-НС1 рН 8,0+0,001 M магний ацетат+0,001 И ЭДТА, прибавляют 0,020 мл фермента (0,05 мг белка) с каждой стадии очистки. Реакао ционную смесь инкубируют 20 мин при

37вС, реакцию останавливают.прогреванием реакционной смеси в течение

1 мин в кипящей водяной бане. Контрольную пробу готовят аналогичным

45 образом, но фермент прибавляют в момент прогревания реакционной смеси.

На пластины Силуфол УФ-254 5 М15 см шприцом наносят по 10 мкл опытной и контрольной реакционной смеси поло в сой, ширина которой не превышает

2-3 мм. Хроматографию проводят в системе растворителей диоксан - изопропиловый спирт - 5 И аммиак - 1 И ацетат аммония (30:1 8::49:3), После хроматографии пластины просматривают в Уф-свете, контуры пятен обводят карандашом, измеряют Rf каждого пятна, идентифицируют образовавшиеся

1 ° 1

5 1013475 продукты реакции и по ним качественно определяют наличие тех или иных ферментов. 1

На стадии грубого экстракта биомассы Е.coll обнаружены следующие з

ФеРменты: ПНФ-аэа, 5 -нУклеотидаза, Аденозин ! нуклеозиддифосфатаза и зкзорибонуклеаза.

На стадии 553-ного насыщенил .сУль- Аденин фатом аммония обнаружены: ПНФ-аза, 16. нУклеозиддифосфатаза и зкзоРибонУкле Гипоксантин аэа, деэамининаза, 5 "нуклеотидаза, ! нуклеозидаза.

На стадии готового продукта обна" ружены: ПНф-аза, нуклеозиддифосфат-- 1S аза и экзорибонуклеаза.

В таблице представлены результаты обнаружения ферментов. б

Продолжение таблицы

0,80 5 "Нуклеотидаз а

0,95 Нуклеозидаза

0,86 Адениндазаминаза

Использование предлагаемого способа по сравнению с известными позволит: расширить диапазон определяемых ферментов. Предлагаемый способ позволяет одновременно определять шесть ферментов обмена нуклеиновых кислот, упростить способ за счет сокраще- ния стадий способа с 10 до 6, исключения сложного и дорогостоящего обо" рудования (хроматографа), исключения труднодоступной смолы Аминекс"6 и дополнительных ферментов (картофельной апиразы и щелочной фосфатазы), исключения ионообменной хроматографии под давлением и при температуре.

Величины 20

Ферменты

2 3

Продукт реакций

Полинуклеотидфосфорилаза

Поли А

Экэорибонуклеаза+нуклеозид". дифосфатаза

0,38

АМФ

Составитель О. Скородумова .

Редактор О.Половка Техред О. Неце

Корректор М.Демчик