Способ получения иммобилизованной кислой протеиназы

 

1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИШ1ОБИЛИЗОВАННОЙ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ путем связывания фермента с носителем, о тли ч.аю щ и йс я тем, что, с целью повышения активности получаемого продукта , ферментсодержгиций раствор предварительно подвергают ацилированига хлорангидрндом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-4,5 и мольном соотношении фермент: ллорангидрид-ls

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3294211/28-13 (22) 02.06.81 (46) 30.04.83. Бюл. Р 16 (72) Н.А.Платз, В.В.Чупов, Л.И.Валуев, К.А.Калунянц, Г.Л.Кейдун, П.М.Яшнова и Л.A.Íàõàïåòÿí (71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена

Трудового Красного Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова и Всесоюзный научно-исследовательский институт Биотехника (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. Мотина Л.И., Нахапетян Л.А,, Оптимизация условий иммобилизации кислой протеиназы из Aspergillus awamori Ïðèêëàäíàÿ биохимия и микробиология, 1979, т. 14, 9 3, с, 410-413.

2. Мотина Л.И., Борисова В.Н., Нахапетян Л.A., Иммобилизация кис-. лой протеиназы из.Asperg11Ius awamori на неорганических носителях с карбоксильными группами,- Прикладная биохимия и микробиология, 1981, т. 16, 9 2, с. 212-218. (54).(57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ путем связывания фермента с носителем, о тл и ч а ю шийсятем, что, с целью повышения активности получаемого про„.SU„„10148S2 A

3(5g С 12 N 9/62У С 12 N ll/08 дукта, ферментсодержащий раствор предварительно подвергают ацилированию хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-4,5 и мольном соотношении фермент: хлорангидрид-1-. (100-400), а связывание фермента с носителем осуществляют совместной полимеризацией ацилированного фермента с.гидрофильным ненасыценным мономером в присутствии бифункцианального сшивающего агента.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве ферментеодержащего раствора используют раствор пектофоетидина П10Х или. его ультраконцентрат.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и - Е ч а ю шийся тем, что в качестве гидрофильного мономера используют акриламид или метакриламид или Н-винилпироллидон, а в качестве сшивающего агента иопользуют N,N-метиленбнсакриламид или диэфир метакриловой кисло- ты и этиленгликоля со степенью полимеризации 3 или 13.

4. Способ по пп. 1-3, о т л и— ч а ю щ.и и с я. тем, чтд полимеризацию проводят при концентрации гидрофильного мономера в реакционной смеси 2 5-20 вес.Ъ, а бифункционального сшивающего агента; 0,1-17 вес.Ъ.

1014882

Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к способу получения препаратов иммобилизованной на синтетических полимерах кислой протеиназы, которая широко применяется в пищевой промышленности и медицине, Изобретение может быть использовано для получения высокоактивных стабильных препаратов иммобилизованных кислых протеиааз, Кислая протеиназа (КП) продуциру- 10 ется микроскопическими грибами вида

Aspergillus при их поверхностной культивации. Существует несколько видов этого гриба, способных продуцировать различные типы протеиназ. Наибольший интерес с точки зрения гидролиза высокомолекулярных белков пред" ставляет КП, выделяемая из Aspergillus foetidIIs> Препарат, получаемый на основе этого продуцента, называемый пектофоетидином П10Х, содержит смесь ферментов, в том числе и КП.

Эта протеиназа стабильна в области рН 2,5-б,0 и успешно применяется для препаративного гидролиза высокомолекулярных белков, присутствующих в некоторйх кислых пищевых напитках и отрицательно сказывающихся на их качестве.

КП из пектофоетидина П10Х имеет молекулярную массу около 40000, инги-З0 бируется N-2,4-динитрофвнил-N-диазоацетилэтилендиамином и пепстатином, а ее активность при 20 С (рН 2,5-б,0) сохраняется лишь в течение 24 ч, после чего укаэанная KII полностью инак" 35 тивируется .

Использование КП для гидролиэа высокомолекулярных белков в силу указанных свойств связано с рядом трудностей, обусловленных низкой стабиль-40 ностью препаратов, приводящей к существенной потере активности КП при проведении гидролиза белков в течение 2-3 ч. Эти трудности могут быть преодолены использованием препаратов 45 иммобилизованного фермента.

Известен способ получения иммобилизованной кислой протеинаэы путем ковалентного связывания фермента с водонерастворимым носителем, заключаюцийся в том, что модифицированное аминопропилтриэтоксисиланом неоргаическое стекло, выступаюцее в роли водонерастворимого носителя, обрабатывают глутаровым алвдвгидом, а затем раствором фермента (1).

Недостатком способа являются низкая ферментативная активность препаратов иммобилизованного фермента (она составляет 23-243 от исходной), 60 а также низкая устойчивость препаратов при хранении за счет гидролиза аэометиновых связей, посредством.которых проводится ковалентное связывание фермента с носителем. 65

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной кислой про-.виназы путем связывания фермента с водонерастворимым носителем, который за-! ключается в обработке нерастворимого

L стекла $ -аминопропилтризтоксисиланом (введение на поверхность стекла первичных реакционноспособных аминогрупп) в ацетоне, последующей обработке модифицированного носителя янтарным ангидридом в диметилформамиде (введение карбоксильных групп) и последующем активировании карбоксильных групп носителя водорастворимыми карбодиимидами и обработке активированного носителя раствором фермента при 4 С в течение 12 ч (2).

Недостатком способа является низкая ферментативная активность иммобилизованного фермента,. составляющая

23-51% от исходной.

Цель изобретения - повышение ферментативной активности °

Поставленная цель достигается тем, что в способе Получения иммобилизованной кислой протеиназы, заключаюцемся в связывании фермента с носителем, ферментосодержащий раствор предварительно подвергают ацилированию хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 2,5-,5 и мольном соотношении фермент: хлорангидрид — 1г(100-400) и связывание

Фермента с носителем осуществляют совместной полимеризацией ацилированного фермента с гидрофильным ненасыщенным мономером в присутствии биФункционального сшивателя.

Обычно в качестве ферментсодержащего раствора используют раствор пектофоетидина П10Х или его ультраконцентрат.

В качестве гидрофильного мономера обычно используют акриламид или иетакриламид или N-винилпироллидон, в качестве сшивающего агента N,N-метиленбисакриламид -или диэфир метакриловой кислоты и этиленгликоля со степенью полимеризации 3 или 13, При этом полимеризацию обычно про- водят при концентрации гидрофильного мономера в реакционной смеси 2,520 вес. Ъ, а бифункционального.сшивающего агента 0,1-1(вес.Ъ, Способ позволяет получать иммобилизованный ферментный препарат на основе кислой протеиназы с активностью 93-99Ъ.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Соответствующее количество пектофоетидина П10Х, имеюцего определенную активность, которая выражается в единицах активности, растворяют в

100 вес.ч. воды, добавляют необходимое количество хлорангидрида, пере1014882

45 Пример 8, Все операции выполняют так же, используя вместо раство50 мешивают в течение 15-20 мин. затем в эту же смесь вносят гидрофильный мономер, бифункциональный мономерсшиватель, инициатор радикальной полимеризации (персульфат аммония) и продувают аргоном в течение 2030 мин. После этого добавляют каталиI затор полимеризации (N, N, N, N-тетраметилэтилендиамин) и полимеризуют 1 ч. После окончания полимеризации получившийся гель измельчают на.нейлоновых ситах, промывают водой и водноспиртовой смесью и оставляют набухать в буфере, в котором предполагается проведение определения Ферментативной активности. Общее время получения геля 4-5 ч.

Образующиеся продукты представляют собой сильно набухающие в воде гидрогели и используются для гидролиза белков либо путем инкубирования соответствующей навески геля с раствором белка, либо путем хроматографирования раствора белка через колонку, заполненную нерастворимым полимером с иммобилизованной КП.

Поскольку исходное вещество представляет собой неочищенный продукт, то количество КП в нем крайне трудно установить. Препараты подобного типа характеризуют относительной активностью, выражаемой в единицах протеолитической активности, При этом за единицу протеолитической активности принимают такое количество фермента в мг, которое вызывает прирост оптической плотности при 280 Нм на одну единицу (при определении активности соответствующим образом) за 1 мин. Поскольку истинное количество КП в пектофоетидине П10Х неизвестно, то активность ее определяется по единицам активности. Так 1 г пектофоетидина

П10Х имеет активность 40 единиц. Протеолитическая активность при этом определяется по 2Ъ-ому раствору. гемоглобина в 0,05 M ацетатном буфере (pH 4,5) при 37 С. Степень связывания фермента определяют по отношению активности получаемого препарата, промытого.до полного вымывания несвязанного белка, к активности исходного, выраженную в В.

Ацилирование хлорангидридами пектофоетидина П10Х в растворе, также как ацилирование его ультраконцентра5

40 та, проводят при рН 2,5-4,5 ° Более высокие значения рН приводят к инактивации фермента. В качестве гидрофильных мономеров используются широкораспространеннае мономеры — акриламид, метакриламид, винилпироллидон и пр. Сшивателями являются типичные бифункциональные мономеры: акрилаты и метакрилаты этиленгликоля или. его тепломеров и полимеров (эфиры ТГМ-З, ТГМ-13 и пр.), N,N-метиленбисакриламид и пр.

Инициаторами радикальной полимеризации служат пераульфаты щелочных металлов с тетраметилэтилендиамином, рибофлавин, которые растворимы в воде и работают при комнатной температуре. Инициатором может служить

Уф-облучение.

Пример 1. 20 r пектофоетидина П10Х растворяют в 100 мл воды охо

I лаждают до 0 С и доводят до рН 2,5.

К этому раствору по каплям добавляют

? г хлорангидрида акриловой кислоты и раствор перемешивают в течение 1520 мин, доводят до комнатной температуры за этот промежуток времени, и в этот же раствор добавляют при перемешивании 5 r акриламида и 0,2 r метиленбисакриламида. В раствор вносят 0,003 r персульфата аммония, продувают аргоном в течение 20-30 мин, добавляют 0,003 r тетраметилэтилендиамина и оставляют на 1 ч. Образовавшийся гель измельчают на нейлоновых ситах, промывают водой и 5Ъ-ным водным этанолом из расчета 0,5 л раствора на 1 г геля. Протеолитическую активность определяют по 2Ъ-ому раствору гемоглобина в качестве субстрата. Гемоглобин растворен в 0 05 М ацетатном буфере (рН 4,5) при 37 С.

Активность через неделю и через месяц определяют аналогичным образом, храня препараты при 4ОC. ра.пектофоетидина (10 г на 100 мл Воды) ультраконцентрат пектофоетидинаП10Х в количестве 100 мл. Содержание активного начала в препарате также равно активности 10 г пектофоетидина П10Х.

Данные по примерам 1-7 приведены

s табл., 1014882

° E и о °

I!I m

3 a

4->

Ф о

<ч о а а

Щ Ю CO !!Ъ Ъ М

1 I

Х Х

Гл н

v o ж ж

Г0 И3 (Ч Ю

СЧ

o u

2С Х

Ф l0 о сч л с

Ю о о сЧ л в 1 ч о

Ch l

1 I

Ф4, I ed о о Ф РФ

Ю л 1

Ж 1

Х 1

65 о о (Ч л о сч л.СЧ Ю (Ч

Ю о о

<Ч

Э edAzedauNeg о а в

Ь (Ч Че

М Ф о о

Ь Ф Г ) о о

<Ъ Е4 о о о о л л

Ю

Ю л о о о о

<. л о о о о

Ю

Ю

00 о ю о о 3 CO о о о о

Ю З ю о о о

ОЭ 10

+CO и

Ф °

М

g х в

Е

Aj о, Х о о о л сЧ а о л

<Ч

D O

cv л

deNHdl1

ЦОНЧГГЭЬЕН ХО икоэи Г еэбаь чхоoнaихму

ЦОНЧГГатЛН

ХО ф ОПГЭЙЭН T 6ЭЙЭЪ ЧХООННИХХ цонйохои z.о ихоонкихмз !!

ЙХООНКИХМЭ ГГИНИйэ дц иГГэл чхooнaихмe ненбеииА:) Л 911 ЭХЭ ЯИЯО О ЕХ ОЭЪИГГОЯ

О Г -aNoHoN odoHalcH@odhèà oaõoýüèþo о !!

Ж

Х л ЭГГиб?ГилнебоГГх окхоэьиГГоу

1

edoazoed gd

1

I

l

1 1rN !чйоa оaz,оэьиГГох

I

1

I ихоонаихмe .-йинийэ, :И! чхоонаихме неяоэьихииоэхобд

1

1.Г ЕНИГГИХЭОфОХЯЭН ОаХОЭЬИГГОХ

Кх

1 ес g ви

1 ХЕВ а !!! 1: о

l г ) 0

1 О

Or, 1

1 !!! Г.ф о

I Ц с

1 АГ!Я

Х Гл и а в ц с

I Я сп

1 12, I I xМ

-хм яво4 ! 1: в ока

1: х иeц жио

1 Х И

1 1

1 Ф Ы оо л

I!Ir Х оюв

Ц их в

OO I хcto

I sIg ц о рц и

Р и о

1 4 Ц

x r. x мхц ам Г о ах ц !с в х

1 Х

1 1

1 !!!

1 Х М,1014882

Составитель О. Скородумова

Редантор Е.Лушникова ТехрЕд C.éèãóíîâà

Корректор A.Äçÿòêî

Заказ 3132/21 Тираж 523

BHHHGH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать высокоактивные препараты иммобилизованной кислой протеиназы. Получающиеся иммобилиэованные препараты стабильны в течение длительного времени (стабильность самой КП всего 24 ч), не требу ет специальной очистки фермента, поскольку предлагаемый способ иммобили-, зацни позволяет одновременно иммоби-. лизовать КП из сырца и сформировать матрицу водонерастворимого носителя, для чего не требуется очищать фермент по известным биохимическим способам.

Способ можно использовать для очистки различных кислых пищевых растворов от высокомолекулярных белков.