Способ получения глутаматдегидрогеназы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛУТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ , предусматривающий , культивирование микроорганизмов продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода и ми пёральные соли, дезинтеграцию мяк- , роорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим вьвделением из него фермента с использованием тепловой обработки и хрома .тографии, от лича ющ и йс я iтем, что, с целью упрощения процесса, из микроорганизмов используют штамм Methy ophiJus methanotovorus ВКМ В-1447Д, культивирование осуществляют в аэробных условиях с и 5пользо ваниём метанола в качестве источника углерода, при этом тепловой обра (Л ботке попвергают,бесклеточный экстракт , a хроматографию проводят последовательно сначала на вСие Sepharose CL-4B, -затем на flEAE-Sepharose.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

IVN

РЕСПУБЛИН

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO.ÄÖËAM ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ,ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ Ву

3(5B С 12 N 9 .06 (2i) . 3390227/2&-13 (22) 28.01 82 (46) 15 05,83.. Вюл. В 18 (72) Ю.A. Троценко, Н.В. Логинова и Н.И. Говорухина . (71). Институт биохимии и физиологии .микроорганизмов AH СССР

:(53) 577.15(088.8) :(56) l; ЯепцвИа 3 .А ;, Иап зйЮй P.Õ. .Pnrif1cation aht Propert,ies of

Glutamate Synihase and G0utamata

Dehydrogenase from Вас188из megateium.- 3. Biochem.;1978ñ 1973, р.4552.

2. Nipnacker E.L., Barker Й.А.

Purification and Properties of NAD.dependent Glutamate Dehydrosenass . from C®ostr1d1um,SB-4;-- Biochim, Biophys., Biophys,", Acta, 1970, р. 212, 225 - 242...SU„„1017730 А (54)(57) СПОСОВ ПОЛУЧВНИя Гду1дщ тДЕГИДРОГЕНАЗЫ, предусматривакнцнй культивирование микроорганизмов— продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода и ми-„ неральные соли, дезинтеграцию микроорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим выделением иэ него фермента с использованием тепловой обработки и хрома,тографии, о т л и ч а ю щ и й.с я

:тем, что, с целью упрощения процесса, из микроорганизмов используют штамм

Nethytophi6us methanoQvorus ВКИ

B-1447Д, культивирование осуществляют в аэробных условиях с использованием метанола в качестве источника углерода, при этом. тепловой обработке псдвергают,бесклеточный .экстракт, а хроматографию проводят последовательно сначала на Вбие Верйагозе С„

CL-4В, затем на ДЕЛЕ-Sepharose.

Ф ь

1017730

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения глутаматдегидрогеназы, которая используется для определения аммиака, сА-кетоглута-, рата, глутамата.

Известен способ получения глутаматдегидрогеназы, предусматривающий культивирование микроорганизмов Baci00us megaterium на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве 10 источника углерода Г1 1.

Известен также способ получения лутаматдегидрогеназы, предусматривающий культивирование микроорганизмов — продуцентов на питательной, 15 среде, содержащей источник углерода и минеральные соли, дезинтеграцию микроорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим выделением из него фермента с исполь- 20 зованием тепловой обработки и хроматографии. Согласно этому способу используют анаэробные микроорганизмы

C8ostri6ium SP4, которые выращивают на питательной среде, содержащей в качестве источника .углерода лизин. ,Для выделения фермента биомассу дезинтегрируют, получают бесклеточный экстракт, который сначала обрабатывают протаминсульфатом, фракционируют сульфатом аммония, затем подвергают тепловой обработке, повторно фракционируют сульфатом аммония, хроматографируют на ДЭАЭ-целлюлозе и Сефадексе-150, Выход фермента 41Ъ, активность 485 ед/мг белка 2).

Недостатком данного метода является сложность процесса, обусловленная необходимостью создания анаэробных условий культивирования (удаление кислорода достигается . 40 при помощи реакции его с водородэм в присутствии. катализатора или пропусканием через культуральный сосуд азота), многостадийностью процесса выделения, а также использованием в качестве источника углерода ценного продукта - лизина.

Цель изобретения . — упрощение процесса.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения глу- .

" таматдегидрогеназы, предусматривающему культивирование микроорганизмов — продуцентов на питательной среде, содержащей источник углерода и ьщнеральнне соли, дезинтеграцию микроорганизмов, получение бесклеточного экстракта с последующим вы-. делением из него фермента с использованием тепловой обработки и хрома тографии из микроорганизмов исполь- 60 эуют штамм Methyl?ophi9us methanotovorus В-1447Д, культивирование осуществляют в аэробных условиях с использованием метанола в качестве источника углерода, при этом тепловой 65 обработке подвергают бесклеточный экстракт, а хроматографию проводят последовательно .сначала íà Вшие

Sepharose CL-4В, затем на ДЕАЕ - сефарозе °

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцента глутаматдегидрогеназы используют штамм .облигатно метилотрофных бактерий Methy0ophiPus methanoFovorus BKN В-1447Д.

Для получения глутаматдегидрогеназы бактерии ВКМ выращивают на питательной среде, содержащей метанол.

Клетки отделяют от среды центрифугированием, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора. После центрифугирования бесклеточный экстракт прогревают 20-40 мин при 5060 С на водяной бане, коагулированный белок отделяют центрифугированием и раствор хроматограйируют на Вшие

Sepharose CL-4B. Далее фракции, со.— держащие глутаматдегидрогеназы, хроматографируют на ДЭАЕ-сефарозе. Выход глутаматдегидрогеназы по отно" шению к бесклеточному экстракту 5060%, удельная активность препарата

500-550 ед/мг белка.

Пример. Бактерии Methytophi-.

0us methano0ovorus ВКМ-В-1447Д выращивают в ферментере с рабочим объемом 60 л на среде следующего состава, г на 1 л .среды: KHiP042 О;

NaC9 0,5; (NH4)2 БО4 2,0; MgSO4 7Й20

ОР0257 Ре504 7Н20 0/01; метанол

5,0, рН среды доводят до 7,0 10%-ным раствором NaOH. Температура выращивания 35 С скорость перемешивания

300 об/мин, аэрация 0,5 объема воздуха в минуту на 1 объем среды. После культивирования (22 ч) клетки собирают на сепараторе ACI -3M.Дальнейшие операции проводят при +4 С, В качестве буферного раствора используют 0 05 M Tpuc-HCE буфер, рН 8,0.

Клетки (100 г) суспендируют в буфере и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (20 кГц, 5 1 мин), гомогенат центрифугируют (30000ср

40 мин) .Бесклеточный экстракт прогре вают на водяной бане при 60 С в течение 30 мин и коагулированный белок отделяют центрифугированием.Экстракт наносят на колонку с Blue Sepharose

CL-4В (30 мл) и элюируют раствором хлористоГо натрия в буфере, градиент концентрации 0 - 0,5 М. Фракции, содержащие глутаматдегидрогенаэу, объединяют, диалиэуют против буфера и наносят на колонку с ДЭАЕ-сефарозой, элюируют раствором „:хлористого натрия (градиент Π— 0,5 М). Объединенные фракции, содержащие глутаматдегидрогенаэу, обессоливают и к полученному препарату для стабилизации фермента добавляют глицерин до 30%.

1017730

Составитель T. Мелентьева .

Редактор Л. Веселовская Техред N. Коштура Корректор,:. йЛарошй

Заказ 3481/28 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Выход глутаматдегидрогеназы 60%, удельная активность 550 ед/мг белка.

Предложенный .способ получения глутаматдегидрогеназы позволяет упростить процесс ее получения..

Фермент получают с хорошим выходом и. высокой активностью.