Штамм @ иб-продуцент протеолитических ферментов

Авторы патента:

ТУРМАНИДЗЕ ЦИЦИНО СЕМЕНОВНА

ПАТАРАЯ ДОДО ДОМЕНТЬЕВНА

ДОЛИДЗЕ ДЖЕМАЛ АКВСЕНТЬЕВИЧ

ДУРМИШИДЗЕ НАЗИ ВАСИЛЬЕВНА

КВЕСИТАДЗЕ ГЕОРГИЙ ИВАНОВИЧ

БЕРИКАШВИЛИ ВИОЛЕТТА ШОТАЕВНА

C12N15C12N9/50 -

Штам4 Actinbroyces firadlae И1Б (коллекция Цеитрального муяея промьтшенньЕк микроорганизмов института ВНИИгенетика, регистрационный номер ЦМПМ8-570) - продуцент протеолитических ферментов..

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

NUINH0I

РЕСПУБЛИК

ЯФЮ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (-2.1) 3384058/28-13 (22) 15.01 82(46) 15.05.83. Бйщ. В 18 (72) Ц.C. Турманидзе, Д.Д. Патарая, Д.А. Долидзе, Н..S. Дурмишидзе, Г.И. Кзеситадзе и В.Ш. Берикашвили (71) Институт биохимии растений

АН Грузинской CCP (53) 557.15(088.8) (56) 13 Прикладная -биохимия и микробиология, 1966, 2,322 .

2. Прикладная биохимия и микробиология, 1968, 4,387.

3. Прикладная бисхимия и микробиология, 1973, 1Х 228...SU„„177 2 (54 ) IQTAMN ACTINONYCES FRAOIAR. ЙБ-..

ПРОДУЦЕН 1 ПРОТЕОЛИТИЧЕСЕИХ ФЕРИЕН .РОВ. . (57) Штамм Actinomyces йгайз.ае ИБ (коллекция Центрального музея ироваааленннх микроорганизмов института

БНИИгенетика, регистрационный номер

UNGNS-570) - продуцент протеолитических Ферментов.

1017732

Изобретение относится к ферментиой промышленности, в частности к получению ноного штамма вЂ” продуцента протеолитических ферментов (протеиназы и эластазы).

Протеиназы и эластаза, образуемые выделенным штаммом, могут бытЬ с успехом использованы в медицине, в частности для,приготовления белковых гидролизатов, предназначенных для парентерального белкового питания 10 больньх, для очищения ожогов, ран от некротических тканей, в легкой промышленности для обезволошивания кожевенного сырья и растворения дермы меховых отходов, в пищевой промыш- ленности для улучшения качества и мягчения мяса.

Известны продуценты протеолитических ферментов вЂ” отдельные представители Actinomyces: Actinomyces аИbus, Act. rinogus. При культивировании этих микроорганизмов получают ферментные препараты, обладающие протеолитической, незначительной трипсиновой, эластолитической и амилолитической активностью 1(и (2(.

Наиболее близким является штамм

Act. fradiae ll9 - продуцент протеиназы и эластазы.(.3.).

Недостатком данного штамма является сравнительно низкий уровень биосинтеза эластазы (фермент, растворяющий эластин вЂ” основной белковый компонент эластичных волокон, встречающихся преимущественно в органах, обладающих большой эластич- 35 ностью: выйная связка, азота, легкие) .

Цель изобретения вЂ” получение штамма - более активного продуцента . протеиназы и особенно эластазы. 40, Новый штамм .Actinomyces fradiae

ИБ выделен из почв.восточной Грузии.

Изучена его спонтанная изменчивость, н результате чего отобран наиболее актинный по биосинтезу протеолити- 45 ческих ферментов культурально-морфологический вариант (вариант III), который имеет активность протеиназы

9,6 ед/мл, эластазы 35 ед/мл. Штамм .хранится н музее коллекций культур

Института биохимии растений AH Гру-! зинской CCP

Морфологические признаки. Морфология штамма Actinomyces fradiae ИБ изучена как путем прижизненного микроскопирования культур, выращенных на разных питательных средах, так и электронным микроскопированием культурыв для выращивания применяются следующие питательные среды. 60

Среда СР-1 с глюкозой,г/лг КНО 1;

КН Р04 Ор5; MgSO4 0,5t НаСР 0,51

СаСС3 1у глюкоза 20;0; агар-агар 20,0.

Среда CP-Iскрахмалом,,г/л: ,КЙОЗ 1! К2НР04 О 5; И950 4 0 P 5 g 65

NaCP 0,5; СаСОЗ 1) Р eS04 следы; крахмал 20.

° Среда CP-?Х, г/л: (НН, )2SO4 2,645 ,К,НРО,„ 2,65| МдСЕ 1,21; КН,РО,, 2,38;

ZnS04 0,02у CuS04 0,01у РеЯО 0,01р .NnCE 0,О8; глюкоза 20; агар 20

Среда I I I, г/n: (НЙ4)2 НР04- К2НРО 2 MgSO 0,1; Насб 9,0; СаСР 0,4;

ГеЯ04 0,02у епБО„ 0,011 глюкоза 201 агар 20.

Крахмало-аммиачный агар, г/лг (NH4)ZSO4 .1; К НРО4 1; WgSO4 i;

NaC l; CaCO> 3; крахмал 17,0; агарагар 20,0.

Мясо-пептонный агар.- водяная мясная вытяжка (1000 мл), г/ла пептон 10,0; НаСР 5; агар-агар 20,0.

Картофельный агар - картофельный отвар 2000 мл, агар-агар 20,0.

Мицелий культуры воздушный, спороносцы неспиральные длинные с крючкообразным завитком на концах. Споры

15-суточной культуры, выращенной на среде СР-I с глюкозой, в электронном микроскопе при увеличении в 12000 раз в основном овальные, продолговатые с .гладкой оболочкой.

Для изучения культуральных свойств применяется ряд синтетических и органических сред. Культивирование проводят при 28 С. Наблюдение за ростом, интенсивностью. окраски воздушного мицелия колонии и среды проводят на

5, 10, 15 и 30-е сутки роста ° Рост на средах СР-I с глюкозой очень. хороший. Воздушный мицелий розовый с бе-! лым оттенком, колонии бесцветные, среда неокрашена.

Среда 1 с крахмалом. Рост очень хороший, воздушный мицелий пушистый, розового цвета, колонии розовые, среда неокрашеиа.

Среда II. Рост очень хороший, воздушный мицелий белый, колоний светчо-коричневые, среда бесцветная.

Среда III Рост средний, культура не образует воздушного мицелия, колонии в среде бесцветные.

Крахмало-аммиачный агар. Рост средний, воздушный мицелий беловатоРоэовый колонии в среде неокрашены

Картофельный агар. Рост очень хо;роший, воздушный мицелий пушистый, бархатистый, розовый, колонии серые, среда бесцветная.

Мясо-пептонный агар. Рост средний, колонии голые, без воздушного мицелия; Цвет колонии среды белый.

Отношение к источникам углерода.

Хорошо усваивает глюкозу, галактозу, ксилозу, мальтозу, крахмал. Слабо усваивает арабиноэу, рафинозу, сорбит. Не. усваивает рамнозу, маннит, сахарозу, лимоннокислый натрий и уксуснохислый натрий.

Отношение к источникам азота. Xoporno усваивает нитрат, о(-аланин, 1-ОЫ7732

Ф-алании, треонин;-аргиннн, лизин, глицин, аспарагиновую кислоту. Умеренно ассимилирует NB4NO>, (БН4) НРО4 мочевину, цистин, метйоннн. Слабо. усваивает НН СВ лейцин, валин, фенилаланин, тироэин, триптофан, гуанин,5 аспарагин, изолейцин °

Отношение к источникам фосфора °

Усваивает разнообразные фосфорные соединения.

В результате определения антибак- 10 териальной способности выявлено, чтокультура активно подавляет рост грамположительных и грамотрьцательных бактерий, некоторых микобактерий, дрожжей, клубеньковых бактерий, грибов и актиномицетов.

На среде, содержащей крахмал в качестве источника углерода, синтезирует протенназу и эластазу.

Активность по протеиназе 9,б ед/мл20 по эластазе 35,0 ед/мл.

Пример l. Штамм Actinomyces.

fradiae ИВ выделен из почв восточной

Грузии ° В результате изучения его спонтанной изменчивости отобран наиболее активный пб биосинтезу протео- литических ферментов культуральноморфологический вариант (вариант 111).

Активность ферментов, ед/мл теолитическая эластолитиче про ская

9,6

35 0

4,3

11,3

Активность протеиназы определяют методом Ансона в модификации Петровой.и Випцюнайте. для определения активности эластаэы использУют метод Вильямса, моди- 45 фицированный Петровой и Зуевой.

Как видно из табл. 1 полученный штамм Ас inomyces fradiae ИБ отличается от Actinomyces fradiae 119 повышенной способностью биосннтеза протеиназы и эластазы.

Установление глубины гидролиза некоторых белков протеиназами Actiâ€” пощусев fradiae ИБ, .а также изучение продуктов протеолиэа позволяют оценить возможности использования этих ферментов для приготовления белковых гидролизатов с целью парентерального белкового питания больных.

Результаты исследований показали, :что протеиназаи эластаэа,выделеннные 60 из комплекса протеолитических ферментов, действуют на казеин, альбумин, эластин, яичный белок, белки крови и осуществляют глубокий гидролиэ этих белков, разрушая от 40 до 85%. 65

Actinamyces fradiae ИБ

Actinomyces fradiae 119 (прототип) Культивирование штамма проводах на среде следующего состава, r/ë:

Крахмал 70,0

Соевая кука 17,6 (НН ) 5О4 0,9..

КН 04 0,8

СаСО3 .3,02ПЯОФ 0 02.

0,01

NnCg 0,01 при 30 С на качалке (180 об/мин) в течение 120 ч.

IloceBHw материалом служит 48-часовая культура, выращенная глубинньи способом на среде следующего состава, г/л:

Крахмал 20,0

Соевая мука 20,0 (НН4)25Ц, Насй 2,5

КН,IO+ 0,5 са(Оз 3,0 при 30 С на качалке (180 об/мин).

Параллельно выращивают Ас 1повуces fradiae 119. данные лабораторной проверки культуральной жидкости на активность ферментов протеолитического комплекса полученного штаьма в сравнении с известным штаммом приведены в табл.1.

Таблица 1 общего числа пептидных связай с образованием свободных аминокислОт И низкомолекулярных пептидов (ди- и трипептидов).

Пример 2. Для проведения протеолнза готовят 2%-ные растворы аль умина, казеина, эластина, яичного белка и белка крови в 0,012И боратном буфере (рН 8,0}, добавляют раствор протеаз в отношении (по весу) субстрат: белок препарата

500:1. Протеолиз проводят при 37 С в течение 72 ч, через каждые 24 часа в раствор гидролиэуеьых белков вносят дополнительно по 1 г фермента. Глубину гидролиза определяют по увеличению количества аминного азота в растворах после протеолиза и выражают в процентах. За 100% принимают количество аминного азота, образовавшегося после кислотного гидролиэа исследуемых белков.

Сравнительная оценка глубины гидролиэа белков препаратами протеаз представлена в табл. 2.

1017732 Таблица 2

« Ю« « »

Глубина гидролиза, %

Препарат, полученный иэ альбумина эластина яичного белка белка крови казеина

Ю«ЮЮ«Ю» «Ю Ю

85,0

67,0

Actinomyces fradiae .ИВ 72,5

Ас Ыошусеа fradiae 119 64,0 .

68,5

40,0