Способ калибровки ультрафильтрационных мембран

 

1. СПОСОБ КАЛИБРОВКИ УЛЬТРА . ФИЛЬТРАЦИОННЫХ ВШМБРАН пропусканием через них растворов веществ с опрё/деленными молекулярными массами, последующим анёшизом фильтра и кон- i центрата, математичер1шй обработкой результатов и построением калибровочных кривых, о т л « ч а ю ia и йс я тем, что, с цепью повышения точности калибровки и снижения ее трудоемкости, в качестве калибровочного раствора используют смесь, содержащую триптофан, бацитрацин, цитохром С, химотрйпснноген, яичный и бычий сывороточный аль($умин и ярглобулин в 0,1 н.фосфатном буфере при рН 6,6, а анализ осуществляют с помощью гель-хроматографии на колонке, наполненной ультрагелем АсАе54, при скорости 9ЛЮЩ1И.ТеМ же фосфатным буфером 4-6 мл/ч. 2. Способ по п. 1, о т л к ч аю щ и и с я тем, что используют смесь, содержащую 0,05.мг/мл триптофана и остальные указанные компоненты в одинаковых количествах,равных 0,5 мг/мп.

„„SU„„1017 А

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

g(SD С 12 Я 1/00; С 12 и 9 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABT0PGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ.(21) 3339036/28-13 .(22) 20.08.81 (46) 15 ° 05 ° 83 . Бюл» 9 18 (72) А.Н»Черкасов, А.Е.Полоцкий, В.Е. Иихайлов, В.П.Жемков, В.A.Êóç нецов и Е.E.Êàòàëåíñêèé (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов (53) 663.. 66 - (088»» 8) (56) 1. Дытнерский ЮИ. Обратный осмос и ультрафильтрация. М., . Химия, 1978, с. 102-106.

2,:Ермолаев Е.Д.- Исследоьлние и разработка ультрафильтрации в .технологии биохимических пренараf

" тов. Автореф. дис. на соис. учен. степенй кандидата технических наук.

Рига, 1979. (54)(57) 1 ° СПОСОБ KAJIHBPOBKH УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИОННЫХ МЕМБРАН пропусканием . через них растворов веществ с oripe- ,деленными молекулярными массами, последукащм анализом филътра и концентрата, математичеокой .обработкой . результатов и построением калибровочных кривых, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью цовыаения точности калибровки и снижения ее трудоемкости, в качестве калибровочного раствора используют .смесь, содержащую триптофан, бацитрацин, цитохром С, химотрйпсиноген, яичный и бычий сывороточный альбумин и яглобулин в 0,1 н.фосфатном буфере при рН 6,6, а анализ осуществляют с помощью гель-хроматографии иа

:колонке, наполненной ультрагелем

АсА 54, при скорости злюции,тем же фосфатным буфером 4-6 мл/ч. Е

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют смесь, содержащую 0,05.мг/мл трип- . тофана и остальные укаэайные компоненты в одинаковых количествах,равных 0,5 мг/мл..

1017734

Изобретение относится к области разделения веществ, а именно к способам калибровки ультрафильтрационных мембран.

Известно использование для калибровки мембран электронной микроскопии и ртутной порометрии(.1 1.

Недостатком этих способов является сложное аппаратурное оформление и трудоемкость. Кроме того, способ электронной микроскопии недостаточ- 10 но эффективен в случае калибровки ультрафильтрационных мембран с малым размером пор, а ртутная порометрия требует высоких давлений, что обычно приводит к деформации мембран. Наиболее близок к предложенному способ калибровки ультрафильтрационных мембран пропусканием через них растворов веществ с определенными мОлекулярными массами, последующим анализом фильтрата и концентрата, математической обработкой результатов и калибровочных кривых. Каждый ком- . понент фильтруется в виде раствора, после чего измеряется концентрация вещества в фильтрате(Сф) и концентрате (С„) и определяется коэффициент задержания (9 ) по формуле

Ч =1-—

Сф

Ск (1) 30

Результатй, полученные по отдельным вешествам с массой N отражаются в виде кривой зависимости Чот EgN.

В качестве калибровочных веществ для калибровки обычно используют фракции ч5 водорастворимых полимеров — декстра:» нов, полиэтиленгликолей, а также глобулярные белки (.2 j .

Недостатком способа является необходимость Использования чистых ве- „ ществ, так как наличие примесей вносит существенную ошибку в результаты калибоовки. Кроме того, способ калибровки весьма трудоемок:(25 дней).. цель изобретения — повышение точ- 45 нбсти калибровки и снижение ее тру.доемкости.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу калибровки ультрафильтрационных мембран пропусканием через них растворов веществ с известными молекулярными массами, последующим анализом фнльтрата и концентрата, математической обработкой результатов и построением калибровочных кривых, в качестве калибровочного раствора испольэуют смесь, содержащую триптофан,бацитрацин, цитохром С, химотрипсиноген, яичный и бычий сыво- 60 роточный альбумин и у-глобулин в

0,1 н ° фосфатном буфере при рН 6,6, а анализ осуществляют с помощью гельхроматографии на колонке, наполненной ультрагелем АсА-54, при скорос- 65 ти элюции тем же фосфатным буфером 46 мл/час.

-Используют смесь, сод ржашую 0,05 мг/мл триптофана и укаэанные компоненты. в одинаковых количествах, равных 0,5 мг/мл.

Калибровка проводится следующим образом.

Смесь для калибровки фильтруют через мембрану. После того, как профильтруется 15-20Ъ от исходного объема (4 мл), отбирают пробы (0,5 мл) фильтрата и концентрата и анализируют концентрации находящихся в них ком- понентов методом гель-фильтрации на колонке, содержашей гель АсА-54 при скорости элюции фосфатным буфером

4-6 мл/ч.

По концентрациям компонентов в фильтрате и концентрате по формуле (1) рассчитывают коэффициент задержания Y.

Выбор экспериментальных условий разделения обусловлен параметрами, при которых достигается полное разделение найденной смеси. Так, изме нение диапазона рН 6,6+0,2, в котором определяется точйость рН при разделении за указанные пределы, приводит к резкому ухудшению разделения компонентов, что связано с их агрегацией и взаимодействием. Также при скоростях меньших 4 мл/ч происходит сильное диффузное размывание, а при скоростях более 6 мл/ч разделение ухудшается за счет неравновесности процесса.

Применение геля АсА-54 по сравнению с другими ультрагелями (AcA-34;

АсА-22) позволяет получить желаемые результаты.

Так, на геле АсА-34. Ие делятся бацитрацин и цитохром, íà АсА-22 — бацитрацин, цитохром, химотрипсиноген. и т.д.

На фиг. 1 приведены обобщенные данные для разных мембран, полученные калибровкой по»смесям (A) и калибровкой по индивидуальным ве- . ществам. (Б). Зависимости пред- ставлены в приведенных координатах

V oz Z где V- коэффициент задержаЯ ния " "+ (щ средняя мо+Т лекулярная масса задержания, d —дисперсия кривой задержания.

Среднеквадратичные погрещности определения кривой задержания, найденные по этим данным составляют: в случае калибровки по смесям — 5Ъ, при калибровке по индивидуальным веществам — 12%.

Калибровка по смесям дает также более плавные кривые зависимости Ч (М) которые наиболее адекватно ото ражают распределение пор по размерам, обнаруженное другими методами.

1017734

В результате замены калибровки по индивидуальным веществам на калибровку IIG смеси время, затрачивае: мое на калибровку, снижается с 3 до

0,5 дня. Это достигается заменой серии ультрафильтрационных опытов со спектрометрическим определением концентраций и предварительным подбором образцов мембран (5-7) с равной проницаемостью на единичный ультрафильтрационный опыт. 10

" Таким образом, при применении данного метода резко сокращается объем трудозатрат на калибровку мембран, достигается строгое единообразие условий фильтрации для всех компонентов смеси, условия фильтрации оказываются более близкими к условиям разделения реальных смесей, что повышает точность ,кривой задержания в результате.при° ближения условий калибровки к ус-! 4 ловиям реальных процессов. Кроме того, смесь может быть многократно использована. Способ может быть применен для калибровки неочищенных бепков.

Пример 1.15 мп модельной смеси, содержащей, мг/л:раствор триптофана Р„(0,05, бацитрацин 0>05, цитохром С 0,5, химотрипсиноген

0,5, яичный 0,5 и бычий сывороточный. 0,5 мг/мл альбумины, г-глобулин

0,5, †.фильтруют через ультрафильтрационную мембрану УАИ-150 производст.ва Владимирского ЗНИИСС и мембрану

Биопор А-2 производства, ВНИИ особо чистых биопрепаратов. После IipoIIycxar ния 4. мл было отбирают по 0,4 мл фильтрата и"концентрата, которые . анализируют на колонке размером 0,9х

60 см, наполненной ультрагелем АсА-54 40 при скорости элюции фосфатным буфером 5 мл/ч (фи< . 2) . По гель-хроматограммам расчитывают концентрации в фильтрате и концентрате отдельных компонентов смеси и строят кривые . 45 задержания укаэанных мембран (фиг.2, светлые кружки) . Для сравнения эти же мембраны калибруют индивидуальными компонентами смеси (фиг.2, темные кружки) ° Как следует из сопоставле- 50 ния данных, калибровка по смесям, .. дает более плавные кривые с меньшим разбросом экспериментальных точек.

Изменение скорости элюции до значения меньших 4 мл/ч и больших 6 мл/ч приводит к ухудшению разделения вещества.

П р и и е р 2. Для -концентрирования.и очистки от низкомолекулярных примесей промыаленного препарата — амилоризина, содержащего целевые ферменты с молекулярными массами)43 тыс, используется мембрана Биопор Т-10, прокалиброванная по смеси. По данным калибровки абсо. лютный предел задержания равен 40 тыс.дальтон. Опыты IIQ концентрированию амилоризина на мембране Биопор T-10 со степенями концентрирования до 25 раз свидетельствуют о полном его задержании. В то же время низкомолекулярные примеси фильтруются с коэффициентом задержания

0,6, что соответствует рассчитанному для них по кривой задержания.мембраны T-10 коэффициенту задержания (0,6+0,05) . Коэффициент задержания, найденный по кривой., построенной по индивидуальным веществам,0,54й0,09.

Сопоставление этих цанных по- казывает, что использование описан1 ного способа позволяет получить бо» лее точные величины. Кроме тогО, использование этого способа позволяет, исходя из молекулярно-массового состава образца и кривой задержания, определенной по смеси, . подсказать результаты очистки. Так, в частности, гель-хроматографический анализ амилоризина позволяет определить молекулярную массу при месей, найти их коэффициент. задержания для мембраны T-10 и рассчитать степень очистки (при концентрировании в 25 раз расчетная степень очистки составляет 3,6. Экспериментальная — 3,9) °

Таким образом, использование изобретений позволяет упростить технологию калибровки ультрафильтрационных мембран и повысить ее точность, а также предсказать результаты очистки смесей веществ на основании более точной калибровки мейбран.

Изобретение может найти широкое применение в процессах, связанных с использованием ультрафильтрационного ,оборудования. ОЛ734 фие 1 фие. 2

ВНИИПИ Заказ 3481/28 . Тираж 523 Подписнбв

Филиал ППП "Патвит", г.ужгород,ул.Провктыая,4