Способ получения карбоксиметилированных @ -1,3-глюканов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОК МЕТИЛИРОВАННЫХ ,3-Г.П10КАНОВ фо мулы I где хотя бы один из R представляет собой CHjCOOH, a остальные - водород, со средней степенью полимеризации (п + 2) от 2 до 1000, где п - О или целое число, или их солей, отличающийся тем, что ,3-глюкан формулы П X он Jn л он где средняя степень полимеризации (п + 2) и п имеют вышеуказанные значения, подвергают взаимодействию с монохлоруксусной кислотой или ее солью щелочного металла в присутствии щелочи с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде соли.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

И ЛФ Ф

РЕСПУБЛИК

09) 03) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР п0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕКИй-И ОТКРЦТИй

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

iw .Е F?3% И .

К ПАТЕНТУ, H,oR (21) 2543704/23-04 (22) 17 ° 11 ° 77 (46) 15.06.83. Бюл. N 22 (72) Такума Сасаки и Юкио Сугино (Япония) (71) Такеда Кемикал Индастриз Лтд (Япония) (53) 547. 458. 1 (088. 8) (56) 1. Hethods in Carbohydrate

Chemistry, Academic Press. New York

and London 1963, р.322. (31) 139143 (32) 18.11.76 (33) Япония (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИМЕТИЛИРОВАННЫХ Р -1,3-ГQOKAHOB фор.мулы I

pug ;C 08 В 37/00 д 61 К 1l 15 где хотя бы один иэ R представляет собой СН СООН, а остальные - водород, со средней степенью полимеризации (и + 2) от 2 до 1000, где n - -0 или целое число, или их солей, о т л ич а ю шийся тем, что $-1,3-глю. кан формулы 0 где средняя степень палимеризации (и + 2) и и имеют вышеуказанные значения, подвергают взаимодействию с монохлоруксусной кислотой или ее солью щелочного металла в присутствии щелочи с последующим выделением целево го продукта в свободном виде или в виде соли.

1024011

Изобретение относится к способу получения новых карбоксиметилированных 1 -1,З-глюканов, обладающих противоопухолевой активностью.

Цель изобретения - получение новых соединений, расширяющих арсенал средств воздействия на живой органим.

Поставленная цель достигается тем, что согласно основанному на известной реакции карбоксиметилирования углеводов ».13 способу получения карбоксиметилированных

Pi""1,3,-глюканов общей формулы

Н,03, 20 где хотя бы один иэ R представляет собой СН СООН, а остальные — атомы водорода, со средней степенью полимеризации (n + 2) от 2 до 1000, где и - 0 мли целое число, или их солей

-1,3-глюкан формулы

СН,ОН

М>ОН где средняя стеПень яолимеризации (n + 2) и и имеют вышеуказанные 35 значения, подвергают взаимодействию с монохлоруксусной кисло ой и ее солью щелочного металла в присутствии щелочи с последующим выделением целевого 40 продукта в свободном виде или в виде соли, Используемый согласно настоящему изобретению в исходный -1,3-глюкан (ТАК-И) содержит Р -1,3-связи в своихд основных гликозидных звеньях и является водонерастворимым, обладает средней степенью полимериэации (бР) и может желатинировать при DP 170 при

О

60 в присутствии воды; его получают путем выращивания микроорганизмов, таких как Agrobacterium radiobacter (iF013l27 АТСС 6466), Agrobacterium

radiobacter (1FO 13126, ATCC 21679, FERN P-1166), Agrobacterium Faeca11s

var, myxogenes NTE-V(iF0-13140, АТСС

21680, FERM P-1168).

В соответствии с настоящим изобре тением используются также и низшие полимеры (TAK-О), получаемые при частичном гидролизе Р -глюкана (TAK-N). TAK-D получают при частичном гидролизе ТАК-N (например,при кислотном гидролизе, щелочном и ферментативном гидролизе с Р -1,3-глюканазой).

Пример 1. В 80 мл изопропилового спирта суспендируют 3 г

ТАК-N (средняя степень полимеризации 5401 и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение

30 мин. Затем медленно добавляют 8 мл

30 -ного раствора гидрата окиси натрия при перемешивании в течение примерно 69 мин. Затем смесь интенсивно перемешивают при комнатной температуре еще в течение примерно 90 мин для предотвращения образования геля, Добавляют 3,6 г монохлоруксусной кислоты и смесь перемешивают при

60-70 С в те ение 5 ч, чтобы прошло карбоксиметилирование. Продукт выделяют фильтрованием и тщательно промывают смесью метанола и уксусной кислоты (7: 3 по объему) . Осадок собирают фильтрованием, хорошо промывают

80i-ным водным метанолом, метанолом и ацетоном в вышеуказанном порядке и высушивают под пониженным давлением, Получают 2,9 г карбоксиметилированного Р -1,3-глюкана (СМТАК ).

Карбоксиметильное содержание (число карбоксиметильных групп на глюкозный остаток) 0,54.

Пример 2. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 r

ТАК-И (степень полимеризации 540) и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин.

Затем при первмешивании добавляют

2 мл 303-ного раствора гидрата окиси натрия четырьмя порциями, т.е. по

0,5 мл с интервалом в 15 мин. Затем смесь перемешивают при комнатной температуре еще в течение 90 мин, после чего тремя порциями добавляют 0,9 г монохлоруксусной кислоты, т.е. по

0,3 r, с интервалами по 10 мин, Карбоксиметилирование проводят при

50 С при перемешивании в течение

150 мин. Продукт собирают центрифугированием,растворяют в 50 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. K нейтральному раствору добавляют 120 мл метанола и полученный осадок собирают центрифугировзнием. Осадок промывают смесью 300 мл 80i-ного водного метанола и 100 мл зтанола, а затем смесью

300 мл 807,-ного водного метанола и

200 мл эфира. Продукт лиофилизируют, . выделяется 1,7 r С 1ТАК.Карбоксиме.тильное содержание 0,75.

Пример 3. В 40 мл изопропи- 5 ловго спирта суспендируют 1,5 r ТАК-й (степень полимеризации 540) и суспензию перемешивают при комнатной температуре 8 течение 30 мин. Затем четырьмя порциями добавляют 4 мл 303ного раствора гидрата окиси натрия, т.е. по 1 мл с интервалами по 15 мин после чего перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин.

После этого добавляют 1,8 г монохлор" 15 уксусной кислоты тремя порциями, т.е. по 0,6 г каждая с интервалами по

10 минут. Смесь перемешивают при

50 С в течение 150 мин. Образоваво шийся в результате карГюксиметилирования продукт собирают центрифугированием, растворяют в 40 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному раствору добавляют 90 мл метанола и полученный осадок собирают центрифугированием. Осадок хорошо промывают смесью 200 мл 80>-ного водного метанола и 100 мл этанола, а затем смесью 200 мл 80 -ного водного эта- З0 нола и 200 мл эфира. Затем продукт лиофилизируют, получают 2,0 г

СИТАК. Карбоксиметильное содержание 1,07.

Пример 4. В 33 мл воды сус35 пендируют 3,2 г ТАК-М (степень полимеризации 255) и при перемешивании при комнатной температуре добавляют

1 г гидрата окиси натрия с последующим добавлением 2,4 г монохлорацета40 та натрия. Карбоксиметилирование проводят при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 2 ч. После этого добавляют снова

1 г гидрата окиси натрия и 2,4 г

45 монохлорацетата натрия и затем реакцию проводят при комнатной температуре при перемешивании в течение

3 ч.Затем добавляют еще l г гидрата окиси натрия и 2,4 монохлорацетата натрия. Реакцию продолжают при комнатной температуре при перемешивании еще в течение 2 ч. К этой реакционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре до тех пор, пока фильтрат не перестает давать красный цвет с фенолфталеином.

11 4

Затем осадок высушивают при 50 С и пониженном давлении. Полученный порошок (3,7 г) растворяют в 90 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой с последующим добавлением 210 мл этанола ° Полученный осадок собирают центрифугированием, промывают 803-ным этанолом и лиофилизируют. Получают,.

2,6 r CMTAK. Карбоксиметильное содержание 0,30.

П р и и е р 5. В 66 мл воды суспендируют 6,4 г ТАК-М (степень полимеризации 255)и в условиях охлаждения льдом при перемешивании добавляют

4г гидрата окиси натрия, а затем

9,6 г монохлорацетата натрия. Карбоксиметилирование проводят при охлажде нии льдом, при перемешивании в течении 2 ч. Затеи снова добавляют 4 r гидрата окиси натрия и 9,6 r монохлорацетата натрия и смесь перемешивают при охлаждении льдом в течение 3 ч. После этого добавляют еще

4 г гидрата окиси натрия и 9,6 г а монохлорацетата натрия и реакцию продолжают при охлаждении льдом и при перемешивании в течение 3. К реакционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре до тех пор, пока фильтрат не перестает давать красную окраску с фенолфталеином, после чего продукт высушивают при 50 С и пониженном о давлении. Полученный порошок < 8,6 r), растворяют в 172 мл воды и нейтрали" зуют уксусной кислотой. Затем после добавления 480 мл этанола осадок собирают центрифугированием, промывают 803-ным этанолом и лиофилизируют.

Получают 5,6 r СМТАК. Карбоксиметильное,содержание 0,36..

Пример 6. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 r

ТАК-0 - низший полимер, получаемый при частичном гидролизе ТАК-N, степень. полимеризации 299. Карбоксиметилирование проводят аналогично примеру 2. Продукт промывают, как в примере 2, получают 1,9 г СИТАК. Карбокси метильное содержание 0,59.

Указанный ТАК-0 суспендируют в

40 мл изопропилового спирта и аналогично примеру 3 осуществляют карбоксиметилирование. Реакционный продукт промывают, как в примере 3, получают 2,2 г CMTAK. Карбоксиметильное содержание 1,1

1024011

Пример 7. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют l,5 r

TAK-D (степень полимеризации 113).

Аналогично примеру 2 проводят карбоксиметилирование, Реакционный продукт собирают цеитрифугированием, растворяют в 40 мл воды и нейтрализуют уксусной кислотой. К нейтральному раствору добавляют 90 мл метанола и полученный осадок собирают центрифугированием, а затем хорошо промывают сначала 200 мл 803-ного метанола, а потом 200 мл водного этанола, после чего лиофилизируют.

Получают 1,4 г СИТАК. Карбоксильное содержание 0,51.

Аналогично описанному из 1,5 г

TAK-0 (степень полимеризации 68) получают 1,4 г СМТАК. Карбоксильное содержание 0,36.

fl р и и е р 8. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 r

TAK-0 (степень полимеризации 113).

Аналогично примеру 3 проводят карбо" 5 ксиметилироваиие. Реакционный продукт промывают, как в примере 7, по- . лучают 2,3 r СИТАК (карбоксильиое содержание 1,22) .

Аналогично описанному из 1,5 г

TAK- Э (степень полимеризации 68) получают 1,4 г СИТАК. Карбоксильное содержание 0,05.

П р и и е р 9. В 40 мл изопропи" лового спирта суспендируют 1„5 r

ТАК-N(Dp 960), и суспензию перемешивают при комнатной температуре в гечеиие 30 мин. Затем при перемешиваиии четырьмя равными горциями добавляют

2 мл 30 -ного раствора гидрата окиси натрия с интервалами по l5 мин. Смесь затем перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Затем добавляют 0,9 г монохлоруксусной кис" лоты тремя равными порциями с интевалами по 10 мин. Карбоксиметилирование проводят таким образом при

50 С при перемешивании в течение

150 мин. Продукт собирают центрифугированием и промывают 20 мл

954-ного изопропилового спирта. Оста,ток повторно суспендируют в 20 мл

954-ного изопропилового спирта и нейтрализуют уксусной кислотой. Полученный осадок собирают центрифугированием, хорошо промывают 904-ным

55 водным метанолом, метанолом и ацетоном в указанном порядке и высушивают под пониженным давлением. Получают

1,6 r CMTAK. Карбоксиметильное содержание 0,40.

Пример 10. В 40 мл изопропилового спирта суспендируют 1,5 r

ТАК-D(DP 15) и суспензию перемешива,ют при комнатной температуре в .течение 30 мин. Затем при перемешивании добавляют 2,4 мл 30>-ного гидрата окиси натрия четырьмя равными порциями с интервалами по 15 мин. Смесь перемешивают при комнатной температуре 90 мин, добавляют 1,08 r моиохлоруксусной кислоты тремя равными порциями с интервалами по 10 мин. Карбоксиметилирование проводят при 50 С при перемешивании в течение 150 мии.

Продукт промывают, как в примере 7, получают 0,8 г СИТАК. Карбсксильное содержание 0,19.

Пример 11. В 33 мл воды растворяют 3,42 г ТАК-О(степень полимеризации 2), при перемешивании при комнатной температуре добавляют 1 r гидрата окиси натрия, а затем

2,9 г моиохлорацетата натрия.Реакцию карбоксиметилирования проводят ,при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение

2 ч. Затем снова добавляют 1 r гидрата окиси натрия и 2,9 г монохлорацетата натрия, затем реакцию проводят при тех же условиях в течение

3 ч. После чего добавляют 1 г гидрата окиси натрия и 2,9 г монохлорацетата натрия. Реакцию проводят при тех же условиях еще в течение 2 ч. К реакционной смеси добавляют 1 л этанола и полученный осадок хорошо промывают этанолом на стеклянном фильтре, высушивают при 50 С и пониженном давлении. полученный; порошок (3,7 г1 добавляют к 80 мл горячего (95 С ) этиленгликоля и смесь перемешивают. Полученный осадок удаляют фильтрованием иа етеклянном фильтре как можно быстрее. Фильтрат концентрируют под пониженным давлением и остаток сушат при 60 С. Получают 2,5 г СИТАК. Карбоксильное содержание 0,30, Данные, характеризующие полученные новые соединения, представлены в табл.3.

il р и м е р 12. В 30 мл раствора азотной кислоты (70".-ная азотная кислота: метанол — 1:10 по обьему)суспеидируют 1,5 г СМТАК. Суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч и фильтруют через стек1024011 лянный фильтр. Твердый остаток на стеклянном фильтре промывают 60 мл

904-ного метанола и после этого 30(ГМл метанола. Промытый твердый осадок суйпендируют в 300 мл дистиллированной воды. Затем прибавляют 370 мг гидрата окиси кальция и смесь пере. мешивают в течение 4 ч, после чего фильтруют через фильтровальную Gyмагу. Фильтрат нейтрализуют 0,1 н.соляной кислотой. К нейтральному раствору прибавляют 450 мл этанола и полученный осадок собирают путем центрифугироввния. Осадок промывают

120 мл 80/-ного этанола и сушат при пониженном давлении. Получают 1,3 г каль циевой соли СИТАК .

Противоопухолевую активность трех . видов СИТАК, полученного из ТАК-N, и обработанного в автоклаве СИТАК 20 исследовали на мышах.

Образцы растворяли в дистиллированной воде для инъекции (рН 7,0).

Один из этих образцов стерилизовали в автоклаве \ 120 С, 25 мин ) перед введением. Шесть миллионов клеток

180 трансплантировали подкожно в правую паховую зону мышам 1СР- 1CL, вес тела которых составлял 23 г.

Узлы опухолей удалили на 35-й день после трансплантации и взвесили.

Средний вес опухоли обработанной группы Т, включающей 5 мышей, сравнивался с контрольной группой С, вклю- 35 чающей 10 мышей, и рассчитывалась степень подавления опухоли (i подавления (С-Т)(Сх100) . На 35-й день были также подсчитаны результаты по нескольким животным с удаленной опу- 4р холью (полная регрессия).

Результаты испытаний представлены в табл.2.

Как показано в таблице 2, все образцы СИТАК при уровне дозы 10 мгlкг существенно подавляют рост опухоли.

Это подавление роста СИТАК наблюдалось при уровнях дозы от 1 до 40 мг/кг.

Эти результаты показывают, что

СИТАК можно стерилизовать без потери

его противоопухолевой активности и можно использовать в Форме, пригодной для инъекции, для лечения рака.

Исследовали противоопухолевое.: действие TAK-N, ТАК-0 и СМТАК при различных способах введения.

ТАК-й (степень полимеризации

540), TAK-0 (степень полимеризации 50), ТАК-0 (степень полимериза" ции 16) и СМТАК по примеру 1 вводили по 5 мгlкг внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно в течение 10 дней ежедневно мышам I C P-1С 1. которым трансплантировали 4 10 клеток за

24 ч до первой инъекции; Степень подавления роста опухоли рассчитывали так же, как описано выше, Результаты испытаний представлены в табл.3.

Как видно из табл.3, в каждом случае наблюдалось существенное подавление роста опухоли. При внутривенном введении TAK"Ì, СИТАК почти полностью подавляли рост опухоли, причем степень подавления составляал свыше 853 при полной регрессии опухоли у 4 или

5 мышей из 5 обработанных мышей.

Таким образом, ТАК-К, СМТАК и ,ТАК-0 эффективны для подавления опухоли при любом способе введения.

f024011

Ф

:! л о о

h И, о и

СЧ л м

Р Ф

cn o - и л со л л о о о н е н о о

° О л л а о

СО л о

tt

С.Э

Ln л

ОЪ

-т л о

И с.Э о

С!

t4

СО СО л о о

tt 0

o o сО ИЪ л л

° »

t0 I

=У 1!

Х!

C; I

IO О л

« о

tI

1.Э л

С-Э л

С:> н (Э « о л с.О

z т

«)С о 0Э о

1 л

Д A с о

0I «:

X o ао

dl Ф

1U X

l0 t0

a ct

r0 l

t — 1 !

I

1

1

СО сО м

СО

ЧЭ О1

О1 -4

М1 О1

cv сч л !

Ч !Ч о л л- сЧ л л

СЧ СЧ л сч! 1

X o о

m o

О а ц о о и

tn м л в л

«ф О1 со о л

-Ф сп л в

° I л с4 м о л о!

« л

1 I

-Ф СО л л л л а -з. м

О1 л

1Г\

МЪ - Ф а!1 ъ0 о о сО О л л

° Ф л

« сЭ1 О

-а. л о

« сч м сч о оэ л

-Ф м

- 0 М

co cn л се л м м! ч !ч

СО СО л о Оъ м

О1

СО л л м л

ОЪ о

1.ГЪ

CO ,м

1 I

In

° о о в

Э ° л о о

СЧ я !ч л л о ° о О м л ь о сО м л

C) tn л л о в tn

Ln л о °

Ln л о а о л у л«

CO м

СО о

О.! 1»

z а

1 у м!

» tь

hC е !

С»

l

1 сС лК

М . сС

1 E

Ыа с:

3- X

:ко 1,,Ф

I

t м 0 е О л со сп сО О1

1

t !

1 °

1 1 1

I

I

I !

1

I

l

1

1 1

1

l !

1

1 !

1

l

I

1 1

1

1

I

I l

1

1

1

1

I о 1

М I

1 о

t

1

I

I .3 1

Ч,Э 1

I

1 !

l

I

l сч 1

It

О 1 .о

I !

I

1

I !

1

1

1 !

ЭС ° л

X (.Э

go

> гл

<4(0! 10

c-. a

v ü

Il0 а а

C 01 с

R0

10I л

X oM

О сч !

0 л

О о х

0:

X X ф

l0 а

2i tx z о 01

Ц

Э Х

1- О

l0 Х

10 л

l0 а 0: о а 10

I»

@X Х

Ц X

xt0 V

oX

<И ЭС

D ì о

l0

„O 0

1кк а

vv +

1- X

Э 0Э I

K ц -. а

0,Э О Cf I0 ,рв taa о

C !0 о - а нс

Э (1024011

Степень

С редний

Образец вес опухоли,r

2,87

0,7

СМТАК

7/7

1.0 0

0,28

4/7

90,2

6/7

99,7

0,01

3,65

О/6

0,77

78,9

1/6

5/6

0,03

99,2

4/6

93,7

0,23

О/6

2,17 клаве

100

6/6

96,8

5/6

0,07

5/6

0,08

96,3

3/6

0,21

90,3

0,18

1/6

91 7

Степень

Контроль

7 30

О/10

Ф

СМТАК по примеру

0,84

87,5

4/5

4%

48,4

3,77

0/5

88,5

О 91

2/5

Контроль по примеру

Простерилизованный в авто= клаве

СМТАК по примеру 1

Простерилизованный в автоСМТАК по примеру 1

Доза, Образец . мг/кг

5х10

5 х 10

5х10

Доза, мг/кг (внутрибрюшинно) 10 х 9

10 х 9

10х9

1 х 10

3 х 10

5х10

5 х 10

10 х 10

15 х 10

20 х 10

40 х 10 способ введения

Средний вес опухоли г подавления опухоли,4 подавления опухоли,4

Таблица 2

Число полных регрессий/число обработанных мышей

Таблица 3

Число полной регрессии/число обработанных мышей

1024011

Продолжение табл. 3

Число полной регрессии/число обработанных мощей

Способ введения

Средний вес опухоли, г

Доза, мг/кг

Образец

О/10

7,30

Контроль

ТАК-1 (0Р 540) 5/5

100

3/5

2,72

4/5

0,17

3,02

2/5

ТАК-О, Г

iv

3/5

0 91 (0P 503

3/5

2 30

4/5

1,06

TAK-0

2,67

3/5 (DP 16) 5 х 10 ip

2/5

iv - внутривенно

++Cd подкожно

" + ip интраперитонально

Составитель Л.Никулина

Редактор Л.Веселовская Техред А.Ач Корректор Г.ОгаР

Заказ 4248/52 Тираж 494

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 х 10

5x10

5 х 10

5 х 10

5х10 зс

5х10 ip

5 х 10 х l0 sc

Степень подавле" ния опухоли,3

° а