Способ культивирования энтомопатогенных бактерий

 

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, включающий засев бактерий и их выращивание на среде, содержащей полностью гвдролизованный источник углерода и полностью или. частично гидролизованный источник азота, отличаюиийс я тем, что, с целью повьшения эффективности способа, источник углерода вводят в процессе выращивания дробно, поддерживая концентрацию в среде на уровне 0,1-1,0% по редуцирующим веществс1М до достижения титра культуральной жидкости выше 5 млрд. клеток/мл после чего введение прекращают, а после S исчерпания в среде редуцируквдих веществ в нее вводят соль уксусной кислоты до конечной концентрации. 0,1-0,3%, причем рН в процессе выращивания поддерживают на уровне 7,3-6,8.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

«««««««

РЕСГМэ ЛИК

Э(Я} А .01 и 63/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTNPbfAO

1

7 д - ";»»}:>»:.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ;::,;, „;::,;,",;,, ц

Н «ВТОР«НОМЪ «ЗИДЕТВ Ь»

»

° Ф

° °

\«« (21) 3376250/30-15 (22) 04.01 ° 82, (46) 15.07 83. Бюл.926 (72) В.Е. Матвеев, P.Õ. Сагиров, В.В. Сергеев, .Д.М. Исакова, В.Ю. Ракитин, A.Â. Эйровщжанц, Л.И. Пескова, Г.Е. Скворцов и Р.П. Комарских (71) Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии и Бердский химический завод (53) 576.8.093(088 ° 8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Во заявке 9 2777387/30-15, кл. С 12К 1/00, 1979..

2. Авторское свидетельство СССР по заявке В 2921395/30-15, кл. A 01H 63/00, 1980.

3. Авторское свидетельство СССР по заявке В 2938125/30-15, кл» А 01}4 63/00, 1980, / (19} (l1} (54 ) (57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, включающий засев бактерий и их выращивание на среде, содержащей полностью гидролизованный источник углерода и полностью или частично гндролизованный источник азота, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения эффективности способа, источник уг« лерода вводят в процессе выращивания дробно, поддерживая концентрацию в среде на уровне 0,1-1,0% по редуцирукицим веществам до достижения титра культуральной жидкости выме 5 млрд. клеток,бмл после чего введение прекращают, а после исчерпания в среде редуцирующих веществ в нее вводят соль уксусной кислоты до конечной концентрации

0,1-0,33, причем рН в процессе выращивания поддерживают на уровне

7,3-6,8 °

1028303

Однако, технология получения этих препаратов отличается низкими титрами получаемых на этапе культиви- 5 рования микробных суспензий, длительностью процессов культивирова" ния, подверженностью культуры в процессе развития фаголизису.

Варианты культивирования энтомопатогенных бактерий предполагают выращивание культуры на средах различного состава, с различным характером аэрации, но при использовании таких общих приемов, как одномомент-. 25 ное введение в среду всего набора пиI тательных компонентов и культивирование без корректировки рН p1) и 52/.

Наиболее близким к предложенному является способ культивирования энто мопатогенных бактерий, заключающийся в том, что энтомопатогенные бактерии выращивают на среде, содержащей полностью гидролизованный до сахаров источник углерода и полностью или частично гидролиэованный источник азота. Компоненты среды при ее приготовлении вносятся полностьй, и про х цесс культивирования ведется без контроля и регулирования значения 40 рН среды в процессе роста культуры (Я.

Недостатки известного способа связаны с одномоментным внесением в среду субстрата и отсутствием конт-,. роля значений рН в процессе культи 45 вирования и заключается в том, что из-за катаболитной репрессии не удается повысить концентрацию сахаров в среде вью 2-3% и использовать полностью потенции культуры, снижение,50 рН культуральной жидкости в началь.ный период культивирования (первые 10-18 ч) задерживает развитие культуры и удлиняет тем самым цикл ферментации.

Целью изобретения является повышение эффективности процесса путем повыаения титра культуральной жидкос ти.

На 25-м ч ферментации титр культуральной жидкости составляет

9,0 млрд. клеток/мл, содержание в среде сахаров 0,053. В этот момент в среду вносят раствор ацетата натрия ,цо конечной концентрации ацетата натрия в среде 0,1Ъ. После этого начиНается процесс дифференциации клеток, выращивание, продолжают еце 12 ч..

Изобретение относится к микробиологической промышленности и macaw ется получения энтоиопатогенных препаратов - средств защиты растений.

Энтомопатогенные препараты являются наиболее эффективными средствами зациты растений от вредителей сельскохозяйственных культур и находят широкое распространение для зациты.лесных и сельскохозяйственных угодий.

Цель достигается тем, что соглас- 60 но способу культивирования энтомопатогенных бактерий, включающему засев, бактерий и их выращивание на среде, содерЖащей полностью гидролизованный источник углерода и полностью или частично гидролнзованный источник азота,:источник углерода вводят в процессе выращивания дробно, поддерживая концентрацию в среде на уровне

0,1-1,0% по редуцирующим веществам до достижения титра культуральной жидкости выше 5 млрд клеток/мл, после . чего введение прекращают, а после исчерпания в среде редуцирующих веществ в нее вводят соль уксусной кис» лоты до конечной концентрации 0,10,3%, причем рН в процессе выращивания поддерживают на уровне 7,3-6,8.

Пример 1.. В аппарат емкостью 250 л загружают 120 л среды следуюцего состава:

Гидролизат кукурузной муки, %(по редуцируюцим веществам) 0,5

Гидролизованные на

50% кормовые дрожжи,Ъ

:по весу, в пересчете на сухие кормо- 4,0 вые дрожжи

Вода, л До 120, рН среды устанавливают на уровне 7,3 °

Среду засевают опоровой культурой в посевной дозе 104 спор/мл. Выращивание осуществляют при 30 С, при аэрации среды. В среде ежечасно определяют содержание свободных сахаров и при снижении их уровня ниже О,ЗЪ, что на блюдается на 12,16, 19 и 22-м ч фер ментации, в среду вносят по 0,63 гидролизата кукурузной муки (по редуцирующим веществам) Внесение таких количеств гидролизата обеспечива ет содержание в среде источника угле. родсодержащего материала на уровне

0,3-1,0%. В общей сложности в- среду дополнительно вносят 2,9% источника углерода.

В процессе выращивания постоянно контролируют величину рН и при ее снижении ниже 6,8 в среду добавляют раствор аммиака, доводя значение рН до 7 3. Процесс корректировки осуцествляют начинай с б-ro ч ферментации до 14-го ч, после чего величину рН поддерживают без подтитровки на уровне 7 3. Всего на процесс поддерживания требуемого значения рН среды идет 1,2 л 20%-ного раствора аммиака.

За общее время ферментации (37 ч) конечный титр жизнеспособных спор составляет 8,1 млрд. спор/мл.

1028303

Составитель А. Макаров

Редактор Л. Веселовская . Техред Т.Иаточка Корректор A.Повх

Заказ 4830/3 Тираж 721 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

При параллельном выращивании той же культуры на среде, содержащей:

Дрожжи кормовые,В 4,0

Кукурузная мука,Ъ 2,0

Гидролизат хлопкового шрота,% 10,0

Вода, л До 1 практически тот же титр спор (8,0 млрд ./мл )достигается лишь на

45.-м ч ферментации.

Контролем служит известный способ 10 (3), предусматривающий внесение в среду всех компонентов питания одномоментно и не предусматривающий корректировку рН и внесение ацетата натрия. 15

Пример 2. В аппарат емкостью 250 л .загружают 120 л среды следующего состава:

Гидролизат кукурузной муки,Ъ 20 по редуци-, рукщим ве1i0 ществам р Ридролизованные на 5ОЪ кормовые дрожжи,З (по весу, в пересчете на, сухие кормо вые дрожжи ., 3,0

Вода,л До 120 рН -среды Устанавливают на уровне 6,8

Среду засевают споровой культурой . .в дозе 1d спор/мл и выращивают при

30 С,: рН среды поддерживают на уровйе 6,8, в период с 7-ro до 35

14-го ч ферментации используют 1 л

203-ного раствора аммиака, после че- го значение рН стабилизируется на урЬвне 6,9.

Дробную подачу гидролизата куку- 4О руаной муки дополнительно осуществляют на 15-м ч роста культуры и при ртом добавляют 1,0% гидролизата

f по редуцирующнм веществам). Сахара исчерпываются в. среде на 20-м ч фер« ментации, и титр в этот момент составляет 5,7 млрд. клеток/мл ° В среду добавляют раствор ацетата натрия до конечной концентрации О,ЗВ.

Общая продолжительность ферментацни составляет 32 ч, и титр жизнеспособных спор в культуральной жидкости 5,8 млрд. спор/мл.

В этих же условиях ту же культуру выращивают на среде, содержащей:

Гидролизат кукурузной муки,% (по редуцирующнм веществам ) 2

Гидролизованные на 50% кормовые дрожжи,З (по весу при пересчете на сухие дрожжи) 3

Вода, л До 120

Все компоненты среды вносят .одномоментно, контроль РН не осуществляют ацетат натрия не добавляют, В процессе ферментации рН среды снимает- . ся до уровня 5,7, затем стабилизируется беэ подтитровки на уровне 7,1.!

Цикл ферментации 38 ч>а конечный титр жизнеспособных спор составляет

4,3 млрд. спор/мп.

IIo сравнению с контролем предложенный способ обеспечивает повыаение титра жизнеспособных спор и сокращение времени фераентации. При этом количественное содержание гидролиэованного субстрата в среде в обоих случаях одинаково (с учетом внесенного дробно в опыте гидролизата углеродсодержащего материала).

Экономический эффект от внедрения предложенного способа составляет

17148,2 тыс.руб.