Способ определения глюкозы

 

СО7ОЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (79) (77) 1 А з(57) с 01 N 27/46

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПИЙ

) и.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (21) 3374891/18-25 (22) 05. 01. 82 (46) 30 ° 07.83,Бюл. У" 28 (72) Ю. Ю. Кулис, В. -С. А. Лауринавичюс, В. В. Гурявичене, М. В. Песлякене, В.Л.Калихман, А.Б.Галицкий и Ю.В.Чир. ков (53) 543. 251 (088. 8) (56) 1,Асатиани Л.С.Ферментные методы анализа.И.,"Наука",1969,с.8-27.

2. Патент США )7 3539459, кл. G 01 N 27/46, опублик. 1970. (прототип).

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающийся в измерении параметров ячейки при проведении злектролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повь . — . ш ния точности измерений, перед измерениями в глюкооксидазную мембрану вводят дополнительно пероксидазу, а электролиз проводят в слабощелочном растворе, в который вводят ферроцианид калия в концентрации, соответствующей предельному току.

1032401

Изобретение относится к исследованию и анализу материалов путем определения электрохимических параметров, а точнее, к электрохимическим методам анализа физиологически активных соединений в присутствии фе рме нтов, Известен способ определения глюкозы с использованием ферментов, заключающийся в измерении параметров 1О ячейки Ьри проведении электролиза в растворе (1 ).

Недостаток способа связан с одноразовым использованием ферментов и применением сложной аппаратуры., 15

Определение глюкозы в крови требует удаления белков.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения глюкозы с ис- 20 пользованием глюкооксидазной мембраны, заключающийся в измерении параметров ячейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество (2). 25

Недостатки известного способа заключаются в том, что при погружении"электрода в исследуемый раствор глюкоза проникает в мембрану, где под действием фермента образуется пеоекись водорода, электрохимическое окисление KQTopoi осуществляется при О,ц В. Способ недостаточно селективен и точен, так как при этом потенциале окисляются также другие вещества, находящиеся в реальных биологических расгворах (аскорбиновая кислота, мочевая кислота, аминокислоты и т.д,) .

Цель изобретения — повышение точности измерений.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающемуся в измерении параметров ячейки при проведении электро-иза в растворе, содержащем анализируемое вещество, перед измерением в глюкооксидазную мембрану вводят дополнительно пероксидазу 5O а электролиз проводят в слабощелочном растворе, в который вводят ферроцианид в концентрации, соответствующей предельному току, Пример 1, 30 мг глюкооксидазы, 50 мг пероксидазы и 100 мг альбумина растворяют в 1 мл 0,0 1М фосфатного буферного раствора рН

7,2; 0,1М КС1. Смесь обрабатывают

0,08 мл 253-ного глутарового альдегида и 0,75 мл выливают на стеклянную подложку площадью 25 см. Высушенную мембрану толщиной 0,1 мм и диаметром 2 мм накладывают на токоподводящий электрод и покрывают диализной мембраной.

Результаты определения глюкозы при помощи мембраны, содержащей глюкооксидазу и пероксидазу, в буферных растворах (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2; 1 мМ ферроцианида калия, 25 С ) представлены в табл.1.

Пример 2. Каталитическую мембрану изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 30 мг пероксидазы как в- примере 1.

Результаты определения глюкозы на платиновом электроде в буферном растворе в зависимости от концентрации ферроцианида калия (рН 7,2;

25 С; концентрация глюкозы 1,2 мМ; о

О,1 В) представлены в табл.2, Данные табл.2 показывают, что резкая зависимость от концентрации

Ферроцианида калия наблюдается до 1 мМ.

Пример 3. Смесь изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 40 мг пероксидазы аналогично примеру 1, но поливают не на стеклянную подложку, а на диализную мембрану. Высушенную мембрану толщиной 0.05 мм накладывают прямо на токоотводящий материал и прикрепляют резиновым кольцом. Определяют количество глюкозы десятикратно разбавленной 0,01 мМ фосфатным буфером (рН 7,2; 0,1 M KC1) крови. Для определения остаточного тока в крови 2 мл десятикратно разбавленной крови обрабатывают 1 мг глюкооксидазы и 1 мг каталазы до полного удаления глюкозы в течение

20 мин. Определение глюкозы проводят как в других примерах.

Результаты определения глюкозы в крови (стеклоуглеродный электрод, ОВ, концентрация K<)Fe (CN)< ) 1 мМ;

0,01 М Фосфатный буфер рН 7,2; и = 5) представлены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что величина остаточного тока не превышает 1 ., так как основные электрохимически активные вещества — аскорбиновая, мочевая кислоты — не окисляются при нулевом потенциале. Способ определения глюкозы обладает высо! 032É01

ЗО

Платиновый электрод

Стеклоуглеродный электрод + 11

Потенциал электрода, В, отн.Ag/AgC! й

Ток, мкА/см .

2.

Ток, мкА/см

8,7

0,3

10,1

10,1

0,2

0,1

9,0

0,0 кой точностью, коэффициент вариации не превышает 23 при n = 5.

Пример 4. Ферментную мембрану из 30 мг глюкооксидазы и 50 мг пероксидазы изготавливают и накла- 5 дывают на платиновый электрод аналогично примеру 3. Мембрану по прототипу готовят в отсутствии пероксидазы.

Предлагаемый способ определения глюкозы по сравнению с прототипом

1 предлагаемый способ - 1мМ ферроцианида калия, ОВ,стеклоуглеродный электрод отличается селективностью и точностью.

Данные табл.ч показывают, что согласно предлагаемому способу аскорби-новая и мочевая кислоты не мешают определению глюкозы, тогда как согласно прототипу концентрация глюкозы, определенная в смесях, в три раза превышает в буферных растворах.

В глюкооксидазной мембране„ содержащей пероксидазу и ферроцианид калия, происходят следующие процессы:

Глюкоза + 0 + Глюкооксидаза - Глю4 конолактон + Н О; Н 0 + 2 Fe(CI)+

+ 2Н +Пероксидаза - 2 Ге(СЙ +

2Н О.

Восстановление образующегося ферроцианида приводит к генерации тока в ячейке.Катодный ток восстановления ферроцианида мало менвется(до 0,18), однако резко падает при более высоких значениях потенциала.

Это определяет наибольший потенциал (0,18) действия ячейки. Наложение отрицательного потенциала, к примеру

0,1 8, приводит к катодному восстановлению кислорода, поэтому является значительным остаточный ток, величина которого меняется от концентрации глюкозы. Именно этим определяется потенциал действия ячейки 0-0,1 8 отн, насыщенного Aa/AgCI электрода. Так как потенциал Ag/AgCl электрода меняется при изменении концентрации

КСl от насыщенного раствора до 0,1М в интервале 0,201-0,3!4 8 отн.н.в.э., то требование проведения электролиза при нулевом потенциале отн. Ад/ЯцС! электрода полностью и однозначно задае условия реализации способа.

Очевидно, вместо Ag/AgCl электрода могут быть применены другие электроды: каломельный, водородный и т.д.

Но тогда способ будет реализован, когда электролит выполняется при . О, 04 8 (нормаль ный, каломельный электрод), + О,"01 В (нормальный водородный электрод)и т.д.

Выбор рН 7,2 обусловлен физиологическим значением этого параметра.

Способ применим и при более высоких рН, однако в более щелочной области уменьшается каталитическая активность ферментов. С этим связано уменьшение тока.Так,если при рН 7,2 и 0,8 мМ глюкозы ток ячейки равен 9,0 мкА/см то при рН 7,36 он равен 8,7 мкА/см, а при рН 7,5 — 6,3 мкА/см.+

Ток ячейки, реализующий предлагаемый способ, зависит от концентрации ферроцианида калия. Из данных табл.2, видно, что при увеличении концентра ции ферроцианида до 1 мМ ток увеличивается, а при концентрациях соединения выше 1 мМ практически перестает меняться. Для того, чтобы ток ячейки не зависел от концентрации медиатора, при .еняются такие его количест,ва, которые соответствуют предельному току, При определении глюкозы в проточных датчиках с целью экономии реагента применяется мМ раствор, но систе-, ма также хорошо действует с использованием 2 или 3 мМ ферроцианида.

Таблица

i 032401

Продолжение табл.!

Стеклоуглеродный электрод

Ток, мкА/см .М Концентрация глюкозы 1 мМ; Концентрация глюкозы 0,8 мМ.

Таблица 2

О, 125 0,25 0,50 1,0

2,0 3 0

5,0 10,0

Ток ячейки,мкА/см 2,64 6,24 7,92 10,32 10,68 11,04 11,10 11,10

Т а б л и ц а

Концентрация глюкозы, Кровь

Ток электрода мкА/си

Остаточный ток, ф мг 4

Крысиная 5,22+0,12

Бычья 6,16 0,11

Таблица 4

Предлагаемый способ

Содержание (концентрация ) Прототип

11,2 мкА/см

Глюкоз а (1 мМ 7

Глюкоза (0,03 мМ7

Аскорбиновая кислота (1 мМ) 2

0,95 мкА/см и

0,003 мкА/см

Мочевая кислота (0,03 М) Составитель Г. Боровик

Техред Т. Маточка Корректор М, Демчик

Редактор А.Лежнина

Закаа 5395/50 Тираж 873 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35„ Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Концентрация ферроцианида калия, мМ

Потенциал электрода, 8, отн.Ag/AgC1

Платиновый электрод

Ток,, мкА/см

83,9+1,9

99,0 1,8 2.

0,32 мкА/см

0,1 мхА/см с0,05

< 0,03

12,0 мкА/см

0,40 мкА/см .Е

26,2 мкА/см