Способ получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИДИГОКСИНОВЫХ , АНТИТЕЛ путем взаимодействия реакционноспособного производного дигоксина с эритроцитами барана, о т л и чающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности диагностикума , в качестве реакционноспособного производного используют дигоксина в количестве

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

319 А (19) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 3, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3497651/28-13 (22) 10.10.82. (46) 07.08.83. Бюл. )) 29 (72) И.Е.Ковалев, О.Ю.Полевая, Л,A.Áàøàðîâà, И.А.Вербицкая и И.М.Ко рочкин (71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений и 2-й MocKoBcKBN ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова ,.(53) 543.9(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство. СССР

Ito заявке 9 3497653/28-13, кл. A 61 К 31/59, 06,10.82.

3(51) A 61 К 31/59) 5 01 М" 33/50 ..7 A 61 В 5/00 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИ.

КУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИДИГОКСИНОВЫХ, АНТИТЕЛ путем взаимодействия реакционноспособного производного дигоксина с эритроцитами барана, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения чувствительности диагностикума, в качестве реакционноспособ" ного производного используют зпоксид диг ксина в количестве (2,0-2, 5)

<10 моль на (1,8-2,0) ° 10 зритроб цитов и процесс проводят при рН 7,5-8,0

1033139 к- хяарнадМнзойноя.4Юсююа

ОН 0

ОН ОК

Изобретение относится к способу получения диагностикума, который может найти применение в медицине и биолбгии для выявления иммунного ответа на дигоксин и рефрактерности застойной недостаточности кровообра . щения при ишемической болезни сердца в кардиологии.

Известен способ получения диагноС тикума для выявления антидигоксиновых антител, заключающийся в том, что . 10 дигоксин окисляют периодатом лития R подвергают взаимодействию с эритроцитами барана при рН 7,0-7,4 и соот« .ношении окисленное производное ди гоксина: эритроциты(0,5-0,6) 10 моль|!

8-2, 0) 101о

С помощью диагHocTHKóìà, получен:ного этим способом, удается выявить. антидигоксиновые айтитела у 65% больных с застойной недостаточностью () кровоОбращения, длительное время леченных сердечнми глюкозидами, в том числе и дивоксином, причем титры антител колебались от 1:4 до 1:64.

Недостатком этого способа является невысокая чувствительность диагности;кума.

Келью изобретения является увеличение чувствительности днагностикум

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения диагностикума для выявления антидигоксиновых антител заключающемуся во взаимодействии реакционноспособного производного дигоксина с эритро-. цитами барана (ЭВ), в качестве реакционноспособного -производиойе, используют эпоксид дигоксина в коли честве (2,0-26 5) 10 но ль на (1,8-2,0) ° 10" эритроцитов и процесс ведут при рН 7,5-8,0.

Используемый в качестве реакционно способного производного эпоксид дигок сина получают эпоксндированием дйгок синам -хлорнадбензойной кислотой. Полученный эпоксид дигоксина без выцеления инкубируют с эритроцитами при

20-25 С и рН 7,5-8,0. Слабощелочная среда необходима для лучшего протекания реакции эпоксида дигоксина с белковыми компонентамк мембраны эритроцита. Повышение рН приводит к лизису и гибели эритроцитов. В этих условиях в реакцию вводят (2,0"2,5)»

<10 моль зпоксида дигоксина на (1,8-2,0) 10 " эритроцитов, что в четыре раза превышает соотношение исходных компонентов в известном спо собе получения днагностикума периодатным обкислением. Введение более

2,5 10 моль эпоксида дигоксина приводит к лизису, агглютинацин и гибели эритроцитов. Ковалентное связывание эпоксида дигоксина с белковымн компонентами мембран эритро цитов протекает по схеме

0 ) 1033139

Номер больного

Номер больного предлагаемкм, известным с

1:16

l 32

26.

1:8

1:4

1:4

1 ° 4

1:15

1:64

1:16

1,16

1:16

1:16

1:S

144

1!4

1:4

1:16

1:16

1:4

Пример 1. К раствору 8м -, 10- моль) дигоксииа в 1,5 мл диоксана и 0,03 мл зтилеигликоля добавляют раствор 2 мГ м-хлорнадбен войной кислоты s 0,5 мл диоксана, выцерживают .1 сут в темноте при 20& 5 . 25 С и добавляют по каплям и при перемешивании к 4 мл 100%-ных (упакованных ) ЭБ, суснецдированиых в 40 мл забуференного трио-буфе» ром физиологического-раствора при 16 рН 8,0. Реакционную массу выдерживают

1 ч при 20-25 С и трижды отмывают эритроциты физиологическим раствором до получения прозрачного супернатанта. 15

Пример 2. Проводят опыт, как в примере 1, на используя 6,4 мг (8 ° 10 моль) дигоксина и 1,6 мг й-хлорнадбенэойной кислоты.

Пример .3. Повторяют пример .О

1 но берут 7,2 мг (9 -10 моль) дигоксина и 1,8 мг N- хлорнадбензой-, ной кислоты.

Пример 4. Титры антндигок- синовых антител определяют реакци-. ей пассивной гемагглютинации. Для этого в каждую лунку микротитратора вводят по 0,025 мл физиологического раствора. Затем в первую лунку вно-. сят 0,025 мл анализируемой сыворотки крови больных, которую предваритель- ЗО но декомплементируют при 57ОС в течение 40 мин. Раститрование сыворотки проводят последовательным переносом иэ каждюй предыдущей в каждую последующую ho капле раство- 35 ра. Затем в каждую лунку добавляют . по капле 1Ъ-ной суапензии ЭБ, ковалентно связанных с дигоксином (диагностикум, полученный в примере 1)

:,и.пластины инкубируют 2 ч в термо" 4О

Титр антидигоксиновых антител при использовании диагностикума, по-. лученного способом известным предлагае-. мым стате при 37 С. В качестве контроль ных опытов проводят аналогичные реак ции исследуемых сывороток с нормаль-. ными 38. Кроме того, излучают возмож. йость неспецифической агглютинации, сыворотки сенсибилиэированных дигоксином зритроцитов, Агглютинацию зритроцитов оценивают визуально по характеру асадка в лунках. Последнее разведение. сыворотки, при котором наблюдается агглютинация, принимают за титр антител при отсутствии агглютинации в контрольных опытах. Go этой методйке в клинических условиях выявляют титры антидигоксиновых антител в сыворотке крови 64 больных с застойной недостаточностью кровообращения, длительное время леченных сер. дечными гликозидами, в том числе дигоксином.

Полученные данные представлены в таблице.

- Таким образом, с помощью диагнастикума, полученного предлагаемым способом, по сравнению с диагностикумом, полученным известным способом, удается существенно увеличить (на 17,5%) количество больных, у ко» торых выявлены антидигоксиновые антитела. Кроме того, увеличивается чувствительность определения титра антидигоксиновых антител на 1-2 раз ведения.

Предлагаемый способ получения диагностикума прост в исполнении, не требует применения дорогостоящего рборудования и реактивов.Поэтому он может найти широкое применение в клиниках страны для выявления рефрактерности застойной недостаточности кровообращения при ишемической болезни сердца.

Титр антидигоксиновык антител при использовании диагностику. ма, полученного способом

1033139

Продолжение таблицы

Номер больного

Титр антидигоксиновых антител при использовании диагностикума, полученного способом

Номер больного

Титр антидигоксиновых антител при использовании диагностнкума,полученного способом известным предлагаемым предлагаемым инзвестным

1:32

1:8

34

1:4

1:8

1:4

1:4

l:32

118

1!16

1:8

36

1:4

1:8

1:32

1:64

1:32

1:16

1}8

l:4

1:8

1:4

14

1:32

1: 1.6

1:4

1:32

1:64

1:16

1:16

1:32

1:8

42

1:8

;1:32

1:16

1:4, 22

1:8

1.: 32

1!4

1:8

1:128

1:32

47

1!4

1:4

17

56

1:8

1:4

-19. 58

l-. 4

1:8 49

1:4

l г4

1!16

1:16

60

l:4

1:64

lã :32

52

1:4

1:4

1:64

1:16

1:8

1:16

Составитель О.Скородумова

Редактор Т,Шарганова Техред Т.Фанта Корректор B,Áóòÿãà

1:16

1:16

1:32

Заказ 5467/7 Тираж 713 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент,. r.Óèãîðîä, ул.Проектная,4

1:16

1:64

1:64

1:16

l:64

1:32

1:54

1:16