Способ определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ ОКИСЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ В МИКРОБНЫХ СУСПЕНЗИЯХ, предусматривающий измерение скорости продуцирования двуокиси углерода, микроорганизмами , отличающийс я тем, что, с целью упрощения процесса, перед измерением скорости продуцирования двуокиси углерода микробные суспензии помещают на полиуретановый носитель, подвешенный на стальной проволоке в стеклянном сосуде с 0,05 N раствором гидрата окиси бария, ВЕадерживают в течение 5-6 ч,а измерение скорости продуцирования двуокиси углерода проводят путем титрования О ,-05 N раствором соляной g кислоты в присутствии фенолфталеина.

. СОЮЗ СОВЕТСНИХ

И ЛОМ

РЕСПУБЛИК (19) (11)

100 C12N100

3(59 С

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ;

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3391551/28-13 (22).05.04.82 (46) 15.08.83. Бюл. Р 30 (72) H.М.Исмайлов и 3.М.Байрамова (71) Сектор микробиологии АН Азербайджанской ССР (53) 576 8(088.8) (56) 1. Имшенецкий A.A.,Ìóðçàêîâ Б.Г.

Определение углекислоты, выделяемой из почвы при различной ее влажности. — -"Микробиология", 1978, 47, 9 6, с. 1086.

2. Уибрейт В.В., Буррис P.Х ° .Штауффер дж.Ф. Манометрические методы изучения тканевого обмена. М., "Иностранная литература", 1951 (про— тотип). (54) (57) СПОСОБ ОпрядКЛКНИя СКОросTH 0K1(CJ1EHHH OP1 AHH 8CKHX CVBCTPATOB В МИКРОБНЫХ СУСПЕНЗИЯХ, предусматривающий измерение скорости ïðî. дуцирования двуокиси углерода микроорганизмами, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения процесса, перед измерением скорости продуцирования двуокиси углерода микробные суспензии помещают на полиуретановый носитель, подвешенный на стальной проволоке в стеклянном сосуде с 0,05 N раствором гидрата окиси бария, выдерживают в течение

5-6 ч, а измерение скорости продуцирования двуокиси углерода проводят путем титрования 0,05 N раствором соляной Я кислоты в присутствии фенолфталеина, 1035064

На чертеже показан предлагаемый прибор.

Изобретение относится к иикробиологии и касается способа определения скорости окисления органических .субстратов в микробных суспенэиях, основанного на определение СО, выделяемого при окислении органичес- 5 кого субстрата, и может быть использовано в научных исследованиях при изучении биохимических особенностей микроорганизмов, а также в промышленности, например в. очистных 10 сооружениях нефтехимических и других производств.при изучении биологической активности и эффективности работы ила.

Известен способ определения скорости окисления органических субст-.. ратов в микробных суспензиях по измерению скорости продуцирования двуокиси углерода (СО )методом. газовой хроматографии (1) .

Недостатком этого способа являет- . ся сложность используемой для анали- за аппаратуры.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях, предусматривающий измерение скорости продуцнрования двуокиси углерода микроорганизмами, Согласно способу измерение образования CO> . проводят манометрическим методом в сосудиках Варбурга (.2) .

Однако гаэообмен осуществляется в замкнутом пространстве, в резуль- 35 тате поглощения кислорода изменяется газовый состав среды, .результатом чего является возможное снижение скорости окисления субстрата во времени. Конструкция аппарата 40

Варбурга такова, что не дает воэможности одновременного изучения более 6 субстратов, что ограничивает его возможности.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях, предусматривающему измерение скорости продуцирования двуокиси углерода микроорганизмами, перед измерением скорости продуцирования двуокиси углерода микробные суспензии помещают на полиуретановый носитель, подвешенный на стальной проволоке в стеклянном сосуде с 0,05 И раствором гидрата окиси бария, выдерживают в течение 5-6 ч, а измерение скорости продуцирования двуокиси углеро-60 да проводят путем титрования 0,05N раствором соляной кислоты в присут ствии фенолфталеина.

Прибор состоит из стеклянной цилиндрической колбочки 1. объемом

25 мм, в которую подвешивается нанизанная на стальной проволоке 3 полоска полиуретановой губки 2 размером 30х8х8 мм. Стальная проволока 3 укрепляется в резиновой пробке

5 через которую проходят стеклянная трубка 4, наполненная натронной известью. Она предназначена для соединения газовой фазы колбочки с наруж-, ным воздухом. Натронная известь пропускает в колбочку кислород, но 1 поглощает углекислоту. Суспензия микроорганизмов объемом 0,1-0,2 мм впитывается в боковые грани полиуретановой губки, органический субстрат добавляется на верхнюю, горизонтальную грань губки. В колбочку наливается 2 мл раствора 0,05N Ва(ОН) .

Полоски полиуретана с суспензией микроорганизмов подвешиваются в колбочке и экспонируется в термостате при 30 С 5-6 ч. При постановке опыта о необходимо следить, чтобы пробка

5 плотно прилегала к горлу колбочки

1.. Определение выделившегося и поглощенного раствором гидрата окиси бария СО осуществляют методом титрования 0,05N раствором НС1 в присутствии фенолфталеина. Для определения СО, имеющегося в воздухе, ставят контрольную колбочку без суспен.зии микроорганизмов.

Об окислении органического субстрата и окислительной активности микроорганизма судят по интенсивности продуцирования СО в присутствии данного субстрата.

Определение окислительной активности проводят для двухсуточных культур микроорганизмов, выращенных на жидких или агаризованных органических или минеральных средах. Культуры отмываются три раза буфером со значениями рН, соответствующими физиологическим. особенностям данного микроорганизма, впитываются в полоску губки и экспонируются в колбочках в присутствии Ва(ОН) .

Через 5-6 ч путем титрования

0,05 NHC1 в присутствии фенолфталеина определяется количество выделившегося СО> по формуле

А-В . 0 05 44 (ACBiw), хcO„ п ° t где A = мл 0,05 N Ba(OH), налитое в колбочку (2 мл)

В = мл 0 05N НС1 пошедшее на титрование;

0,05 — нормальность раствора Ва(ОН) ;

44 — мг-эквивалент CO>., и — вес биомассы, добавленной в губку;

t — - время экспозиции;

АСБ - абсолютно сухая биомасса.

Количество выделившегося СО представляют в мг на 1 мг сухой биомассы

3 1035064 конец полоски не долйен соприкасать ся с поверхностью раствора Ba(OH) .

Одновременно с опытными колбами ,ставятся контрольные без микробной суспензии дпя учета углекислого газа воздуха в колбочке. Колбочки .экспонируют в термостате при 2830 С 5 ч. Колбочки. в эжт период иногда осторожно встряхивают. По окончании времени экспозиции в кол10 бочки добавляется капля фенолфталеи-. на и избыток гидрата окиси бария титруется 0,05N раствором соляной кислоты до обесцвечивания. По разнице между титрованием контроля и

15 опыта определяется количество выделившегося углекислого газа микробной суспензией. Интенсивность продуцирования СО выражается в мг на

1 мг сухой биомассы за 5 ч. Ошибка щ определения --до 3-5%.

Ил

0 i 05NHC1 прошло на титрова.— ние а

С вычетом контроля

СО.

2-а .

Варианты мг мл Контроль

1,95

0,05

Эндогенное (безсубстратное) 0,25 0,20

0 71 0,66

1,75

0,22

112

Н -Гексадекан

Толуол 1

1,29

0,726

372 е

146

1,69

0,31 0,26

0,286

0,990

0,935

0,22

Зтилбензол

1,05

0,95 . 0,90

507

Н-Гексилбензол

Бензол

0,85

0,9

479

1,75

112

0 25

0 у20

Как видно иэ таблицы, дрожжи

С.цШ11iermondii 916 способны окислять все углеводороды, хотя с различной интенсивностью. Лучше всех окисляются этилбензол и н -гексилбензбл, далее следует н -гексадекан.

Толуол окисляется слабее, бензол не окисляется совсем.

Пример .2 ° 2-суточная культура бактерий Pseudomonas aeruginosa шт. 7, выращенная на мясо-пептонном . 60 агаре, смывается с поверхности среды и отмывается три раза фосфатным буфером рН 6,8 на центрифуге. ПоАученные клетки разводят буфером для получения бактериальной суспензии за 1 ч. Абсолютно сухую биомассу можно выразить также содержанием азота, в этом случае количество СО выражают в мг на 1 мл азота за 1 ч,.

Делением весового значения СО2

° íà 0,00195 можно получить объемные значения СО в микролитрах (л ).

Пример 1 . 2-суточная куль.Tvoa дрожжей Candida дп11liermondii

916,выращенная на сусло-агаре,смыва- ется с поверхности среды и отмывается три раза фосфатным буфером рН 5,4.

Полученную пасту разводят тем же . буфером для получения суспензии с оптической плотностью D = 1,2-1,5

0,2 мл (1 мг) этой суспензии впитывается в полоски поролона, предварительно надетого на проволоку. На верхнюю часть полоски добавляются

0,02 мл Н-гексадекана. В колбу добавляется 2 мл раствора 0,05N Ba(OH) .

Резиновой пробкой с проволокой и надетой на проволоку полоской поролона плотно закрывают колбу таким образом, чтобы полоска поролона была полностью в колбочке,.нижний !

В таблице показано продуцирование

СО клеточными суспензиями дрожжей

C. .guilliermondii BKM4-916 fмг, мп на /1.мг сухих клеток /5 ч)

t с оптической плотностью D = 01,5 2,0. Суспензия в количестве 0,2 мл (0,05 мг) вносится на поверхность поролоновых полосок, надетых предварительно на стальную проволоку в резиновой пробке. На верхнюю часть полоски добавляется 0,02 мл псевдокумола. Помещают полоску в колбочку, куда предварительно вливается 2 мл

0,050 раствора Ва(ОН)р,.плотно закрывают пробку, колбочки выдерживают в термостате 5 .ч при 30-32 С.

По окончании экспозиции в колбочках определяется содержание выделившегося СО по методу, описанному в .примере 1.

1035064

Составитель В.Голимбет

Редактор .Л.Авраменко Техред М. Костик Корректор В.Бутяга

Заказ 5759/23 TH pcUK 5 23 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рауыская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Использование предлагаемого способа определения скорости окисления органических субстратов в микробных суспензиях обеспечивает по сравнению с известным способом сле дующие преимущества: определение окисления органических субстратов значительно упрощается, так как предлагаемая конструкция прибора проста и доступна любой лаборатории создается воэможность проведения анализа не только в лабораторых условиях, но и непосредственно в полевых условиях, в экспедиции; отпадает необходимость в приобретении сложного и дорогого оборудования; в аппарате Варбурга при наличии полного набора манометров возможно одновременное изучение окисления не более 6 органических субстратов.

Приборов предлагаемой конструкции можно изготовить в количестве необ.ходимом для изучения одновременно

10 неограниченного количества субстратов, что значительно экономит. время.