Способ получения модифицированной урокиназы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ УРОКИНАЗЫ, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью обеспечения комплексной пролонгированной тромболитической и сосудорасширяющей активности целевого продукта , урокиназу подвергают взаимодействию с нитропруссидом натрия при рН 8,3-9,0. . (Я

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3252672/28-13 .(22) 03.03.81 (46) 15.04.85. Вюл. № 14 (72) А.В. Максименко, В.В. Кухарчук, В.П. Торчилин, О.С. Медведев, П.М. Лещинский, Г;Г. Арабидзе и В.Н. Смирнов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР н Научноисследовательский .институт фармакологии АМН СССР. (53). 577.15.07(088.8) (56) 1. Т.. Kitao, К. Hattori.

Thrombos. Haemostas. 1980, 43, 70.

2. Авторское свидетельство СССР но заявке ¹ 2821712/23-04, кл. С 12 .N 9/72, 1979.

3. Авторское свидетельство СССР № 824053, кл. G 01 N 33/86 1979

„„SU „„1037683

4{51) С, 12 Н 9/72; С 12 N 9/96//

А 61 К 37/48.(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННОЙ УРОКИНАЗЫ, отличающийся тем, что, с целью обес" печения комплексной пролонгированной тромболитической и сосудорасширяющей активности целевого продук. та, урокиназу подвергают взаимодействию с нитропруссидом натрия при рН 8,3-9,0.

1037683

Изобретение относится к химикофармацевтической промьппленности, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, обладающих сосудорасширяющей и тромбо- 5 литической активностью.

Известен способ получения модифицированной урокинаэы, связанной с высокомолекулярными носителями, обладающей тромболитической актив- 10 ностью Я .

Способ заключается в том, что урокиназу связывают с помощью бифункционального реагента 4,4 -диизоl тиоциано-2,2 "стильбен дисульфона- 15

l .та с эритроцйтарной массой человека.

Такой способ получения производных белка довольно трудоемок, а образующийся продукт не растворим в во— де, что затрудняет его медицинское 20 использование.

Более близким по достигаемому результату является способ голучения модифицированной урокиназы, который заключается в том, что уроки- 25 назу подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-207, предварительно 5() обработанным карбодиимидом, причем процесс ведут при рН 8,0-8.3 (2) .

Получаемое производное обладает пролонгированной тромболитической активностью, растворимо в 35 воде, является биосовместимым с живым организмом.

Таким образом, известный способ обеспечивает получение биологически активного вещества, обладающего 40 лишь одним видом специфического действия на живой организм, что ог.раничивает сферу его возможного использования, В связи с этим создание препа- 45

- ратов, обладающих одновременно несколькими видами биологической активности, весьма перспективно, поскольку за счет многосторонности действия препарата снижается коли- N чество назначаемых больному лекарственных средств, из-за пролонгации действия компонентов препарата повышается эффективность терапии

11 заболевания, уменьшается риск ле- 55

Н карственной болезни.

Целью изобретения является обеспечение комплексной биологической активности модифицированной урокиназы, а именно — комплексной пролонгированной тромболитической и сосударасширяющей активности целевого продукта.

Указанная цель достигается описываемым способом получения модифицированной урокиназы, который заключается в том, что урокиназу подвергают взаимодействию с нитро руссидом натрия при рН 8,3-9,0.

Соединения, получаемые описываемым способом, представляют собой продукт связывания урокиназы с нитропруссидом натрия. Нитропруссид натрия обладает гипотензивным действием за счет дилятирующего воздействия на гладкую мускулатуру периферических кровеносных сосудов и снижения общего периферического сопротивления. Гипотензивное действие нитропруссида натрия при его введении в организм проявляется быстро, однако и быстро заканчивается при прекращении введения препарата.

Урокиназа, являясь активатором плазминогена в организме, обладает тромболитическими свойствами, в связи с чем ее применяют при лечении заболеваний, сопровождающихся повышением внутрисосудистой коагуляции.

При тромбозах и особенно при эмболиях довольно часто наблюдаются сосудистые спазмы. Ликвидация таких нарушений, очевидно, будет более эффективной не только при использовании тромболитических, но и сосудорасширяющих средств. Особенностью действия нитропруссида натрая является его способность влиять на тонус артериол и вен.

Способ осуществляется следующим образом.

К урокиназе в 0,001 — 0,3 M растворе фосфатного буфера добавляют нитропруссид натрия, реакцию проводят при температуре от 0 до 25 С в слабощелочной среде в течение

0,1-5,0 ч. Затем полученное производное подвергают очистке диалиэом в течение 36 ч против дистиллированной воды.

Взаимодействие урокиназы с нитропруссидом натрия происходит по

1037683

С=О+ С =-N

0К

+Н О С

2 + г

О

Г

+Ой

СМЯ схеме циангидринного синтеза, когда карбонильная компонента белка связыВместе с тем связывание нитропрусси" да с урокиназой проходит и через взаимодействие трехвалентного железа с сульфгидрильными группами белка:

Е-SH+IFe(СИ)

+. HCN

Именно таким способом. происходит растворение нитропруссида натрия в . крови и тканях, когда трехвалент-. ное железо из молекулы нитропруссида натрия взаимодействует с сульфгидрильными группами эритроцитов.

Полученный продукт представляет собой урокиназу, модифицированную нитропруесидом натрия. При этом нитропруссид натрия оказывается переведенным в состояние, когда он постепенно "сходит" с белковой глобулы, проявляя свое пролонгированное гипотензивное действие. Фермент после модификации сохраняет 85-90Х исходной каталитической активности (в .качестве субстрата применяют метиловый эфир.ацетилглициллизина),. но термостабкяъности весьма стоек и не уступает нативному белку, ингибируется алаэмацитратом заметно меньше, чем нативный препарат. Про-. дукт сохраняет свою пролонгирован- . ную биологическую активйость при хранении s холодильнике .(4-5 С) в растворенном виде в течение месяца.

Пример -1 В4млО,f м фосфатного буфера рН 8,8 растворяют

256000 IU урокиназы (80 мг сухого вещества, 10 М), затем вносят в раствор 50 мг нитропруссида натриа (2 10 М) и смесь инкубируют прв 5 С в течение 3 ч.:После этого препарат подвергают очистке диализеи в течение ночи против дйстиплшреванной воды. Концентрация свявается с циановой компонентой нит-, ропруссида натрия:

С=И

tS эанного с ферментом нитропруссида

5 ° 10 М. Фермент сохраняет 85X..

; своей эстеразной активности (AGL Ие), не уступает iso термостабильности нативному белку, слабее чем.он

26 ингибируется плазма цитратом. Содержание белка в препарате б5Х.

Продукт представляет. собой бурокоричневый порошок, легко растворимый в воде.и спирте (до 40 мг/мл)..

25 . П р и м .е р 2. Процесс.проводят так же, как и в примере 1, за исключением того, что реакцию мо. дификации урокиназы нитропруссидом натрия осуществляют в .0,001 М фосщ фатом буфера, рН.9,0 при 25 С в течение 5; Остаточная каталитическая активность фермента 87Х. При этом концентрация связанного с белком нитропруссида натрия 1-10 М.

Свойства урокиназы близки тем, что . приведены в примере f.

Содержание белка в препарате

74Х.

Пример 3. Процесс лрово40 дят также, как и в .примере 1 за исключением того, что .реакцию моди-фикации урокиназы нитропруссидом натрия ведут в 0,3 М растворе фос-.

4S

Фатного буфера.рН 8,3 при ОоС .в течение 0,1 ч. Остаточная катали-.тическая активность фермента 90Х.

При этом с ферментом связывается

7 10 И нитролруссида натрия, а

Э свойства урокиназы близки тем .которые указаны в нрнмере 1.

Содержание белка в.препарате 80Х.

При этом модификацйя урокиназы нитропруссидам натрия не вызывает

55 сильного изменения свойств фермента. Tare реакция каталитического гидролиза урокиназой синтетичес-.

«ого субстрата меткпового эфира ацеткпглициллизииа осуществляется

1037683 по схеме активации хода реакции субстратом (схема i). Продукты примеров 1-3 также осуществляют эту реакцию по указанной схеме. схема 1

Кинетические параметры этой реакции для препаратов нативной и мо дифицированной урокиназы приведены в табл. 1 (рН S 3; 25 С; 0,1 М

КСВ) .

Производные урокиназы, полученные в примерах 1-3, содержат различное количество нитропруссида нат- 20 рия, связанного с ферментом. Это объясняется важной ролью величины рН инкубационной смеси, когда реакционноспособные группы, важные для реакции связывания, должны быть иони-25 зованы, а при этом сама реакция обратима. Оптимальным значением является рН 8,8. За счет связывания с глобулой- белка выход s кровоток активной формы нитропруссида натрия зв замедляется, в результате чего его сосудорасщиряющее действие приобретает пролонгированный характер.

Для определения гипотензивиого эффекта иитропруссида натрия, связанного с урокиназой. был проведен эксперимент на крысах-линии "Вистар". Юркоэ осуществляли с помощью тиопентала натрия. Затем выделяли. сонную артерию и яремную вену, в. 4(( которые вводили полиэтиленовые катетеры. Непрерывно регистрировали артериальное давление до введения препарата в момент и после введе1 ния.

1 этап опыта заключался во внутривенном введении нативного нитропруесида натрия в дозе 30 мкг/кг веса, животного. Препарат вводили болюсом. Следили за максимальной величиной снижения среднего артериального давления и за временем его, возвращения к исходным цифрам, Ha II этапе опыта вводили нитропруссид .натрия, иммобилизованный на урокиназе. Оценивали те же парамет-, ры.

Получены следующие результаты: введение нативного препарата вызывало снижение среднего АД на 40507. по отношению к исходному. Макси" мум снижения наблюдался через 1124 с после введения болюса. Возвращение Ag к исходному уровню происходило в среднем через 1 мин.

Введение иммобилизованного препарата вызывало снижение среднего

АД на 65-70Х от исходного через 1521 с от начала введения. Вслед за этим наблюдалось постепенное повышение АД и через 3,5-7 мин оно воз- . вращалось к исходному уровню, Таким образом, нитропруссид натрия, связанный с урокиназой, в сопоставимой дозе при введении болюсом действует в 3,5-. 7 раз дольше (длительнее), чем препарат нитропруссида натрия в свободном виде, о чем свидетельствуют приведенные в табл. 2 результаты.

Эксперименты по лизису тромбов препаратами урокиназы, модифицированной нитропруссидом натрия, были проведены в соответствии с известной методикой (3) с добавлением в раствор буфера человеческого плазминоге-, на (0,4 мг/мл}. Препараты нативной и модифицированной урокиназы были взяты для тромболизиса в соотношении, обеспечивающем их одинаковую экстреразную активность по низкомолекулярному субстрату метиловому эфиру ацетилглициллизина. Результаты экспериментов приведены в табл. 3, где tg ñ6 представляет собой отношение прироста оптической плотности раствора (в результате деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и перехода его фрагментов в раствор) к величине промежутка времени, sa который оно произошло и является параметром, характеризующим скорость тромболизиса. (Представленные в таблице результаты наглядно показывают, что по эффективности тромболизиса препараты модифицированной нитропруссидом натрия урокиназы не уступают препаратам нативного фермента, являющегося высокоактивным тромболитиком. Пониженная ингибируемость (приблизительно в 3-5 раз) плазмацитратом препаратов модифицированной урокиназы ro сравнению с натив.

1037683

Таблица 1!

Кз, И

cat > с-1

Препарат

Нативная урокиназа

Продукт примера 1

Продукт примера 2

Продукт примера 3

2,14 х 10

5,7х10

4,3 х10

3,2х10

5 5 х 10

9,1 х10

7,0 х 10

6,7 х 10

42,72

28,47

36,81

38,93

1,82

1,88 ным белком обеспечивает более длительный период тромболитического действия этого препарата в организме.

Таким образом, ковалентное при- 5 соединение нитропруссида натрия к урокиназе позволяет получить новый препарат, обладающий сосудорасширяющим и тромболитическим дейст.вием, При этом замедление перехода фрагментов молекул нитропруссида натрия с глобулы урокиназы в раствор обуславливает пролонгированный характер действия этого вазодиллятатора, а модификация урокиназы та- 15

1 ким низкомолекулярным лигандом как нитропруссид натрия не меняет существенно кинетические свойства фермента, понижает его ингибируемость компонентами крови, за счет чего 20 возрастает время активного функцио. нироваиия тромболитика в организме.

Таким образом, полученный препарат представляет собой новое средство комбинированного воздействия на заболевание, причем сосудорасширяющие и тромболитические свойства его компонентов оказываются у него не адцнтивными частями, а усиливают друг друга, придавая характер пролонгированного действия получаемому производному.

Получение терапевтических средств расширенного спектра действия несомненно весьма актуально, поскольку ведет не только к развитию новых методов терапии, вооружает врачей высокоэффективными лекарственными средствами, но и облегчает сам курс лечения, является весьма удобным и для медицинской практики, сокращая число инъекций. больному. Простота и легкость синтеза модифицированной нитропруссидсм натрия урокиназы позволяет надеяться на возможность быстрого получения этого препарата комбинированного действия.

Появление такого лекарственного средства в арсенале врача расширит возможности борьбы с заболеванием и позволит перейти от струйных методов введения препарата к инъекционным.

1037683

Таблица 2

Гипотензивный зффект урокиназы, модифицированной нитропруссидом натрия

Препарат

Свободный нитропруссид натрия

60

420

70

Продукт примера 1

Продукт примера 2

300

Продукт примера 3

210

Таблица 3

Тромболитическое действие урокиназы, модифицированной нитропруссидом натрия

Скорость лизиса тромба

Вид препарата

100

0,16

Нативная урокиназа

Продукт примера 1

113

106

0,17

Продукт примера 2

0,15

Продукт примера 3

ВНИИПИ Заказ 2769/1 .Тираж 525 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Величина снижения артериального давления, Х от исходного

Время максимального снижения артериального давления, с

Время, за которое артериальное давление поднимается до первоначального уровня, с