Штамм @ @ -4994-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы
Штамм Bordetella bronchiseptica-4994 (коллекция Научно-исследовательского ордена Трудового Красного Знамени института им. акад. И.Ф.Гамалеиt регистрационный номер 15) - продуцент сайт-специфической эндонуклеаэы. (Л с ее
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ OGY4APGTBEHHblA HOMHTET GGGP ПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTVQ (21) 3385723/ 28-13 (22) 11.01.82 (46) 30.05.85. Вюл. У 20 (72) В.Н.Калинин, И.А.Лапаева, В.Г.Лунин, О.И.Золотова и Т.И.Тихоненко (71). Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского и Ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. Н.Ф.Гамалеи (53) 575.15(088.8) . (56) 1. Old R.W. et al. Recognition sequence from restrictjon endonuм юа(J.Ио1.Biol. 1975, v. 92, р. 331341. 2. Roberts R.J. Restriction and modification епгушев and their recognition sequences, Nucl.Àñids Res, 1981, v. 9, р. 75. 3. Greenway P.J. The isolation of à restriction enzyme from фдЯдtella егйиваiа Вiochem.Biophys. Res. Comm., 1980, v. 95, р. 12821287. „„SU„„1040794 (54) ШТАММ BORDETELLA BRONCHISEPTICA-4994-ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПКЦИФИЧКСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ, (57) Штамм Bordetella bronchiseptica-4994 (коллекция Научно-исследовательского ордена Трудового Крас-,. ного Знамени института им. акад. Н.Ф.Гамалеи, регистрационный номер 15) — продуцент сайт-специфической эндонуклеаэы. ультразвуком. Обломки бактерий осаждали центрифугированием (100 000 g, 90 мин при 2-4 С) Надосадочную жидкость разбавляли PC буфером в 8 раз и наносили на колонку голубой сефарозы (Blue Sepharose "Pharmacia", Швеция), размером 1,6 ° 10 см, уравновешенную РС буфером с 0,2 М NaCl Колонку промывали таким же раство,ром до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюировали 100 мл градиентом 0,2 М NaCl - 2,0 М NaC1 с 30Х глицерина в PC буфере. Объем каждой фракции составлял 5 мл. Аликвоту из каждой фракции (2 мкл) инкубировалн 1 ч при .37 С с t мкг ДНК фага Ь .и анализировали электрофорезом в гчяе 1 агарозы. Фракции,; расщепляющне ДНК фага Л на Hind III-специфические фрагменты объединяли, днализовали 1 1040 Изобретение относится к области микробиологии и генной. инженерии, в частности к получению сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции BbrI, аналога рестриктазы НиЫ III. Известны микроорганизмь-. продуценты эндонуклеаз типа Hind III из рода Haemophilus 51 2). Известен также штамм Bordetella pertussis, продуцирующий рестрикта- !О эу BpeI, которая гидролизует ДНК фагов Д, h 989, 3 641, аденовируса. человека типа 2 и плазмиды pJDB219, так же, как и Hind Ш (3 j. Однако известные штампы патоген- д ны для человека, требовательны к обогащенньм питательным средам и продуцируют другие типы эндонуклеаз, что затрудняет выделение и получение чистого фермента. 20 ° I Цель изобретения — выявление штам-. ма-продуцента, непатогенного дитя человека, нетребовательного к питательный средам и селективно продуцирующего одну сайч-специфическую 2$ эндонуклеазу типа Hind III. Штамм Bordetella bronchiseptica4994 выделен от кролика, клонирован по устойчивости к фагам коклюшного и бронхосептикоэного микробов и хра- ЗО нится в коллекции научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.акад.Н.Ф.Гамалеи под регистрационными номером 15. Морфологические признаки. Мел-. 3S кие подвижные овоидной формы коккобациллы размером 0,3-0,5 0,8-0,2 мкм. При электронно-микроскопичеоком исследовании выявлены латеральные жгу- тикиe 40 Культуральные признаки . Среда Ворде-Жангу (картофельноглицериновый агар) . Колонии серого цвета, блестящие, с гладкими краями, через 24 ч достигают 1,0 мм в диаметре. Гемолиз не выявлен. Среда КУА (казеиново-угольный агар). Колонии серовато-кремового . цвета, вязкой консистенции, с гладкими краями, через 24 ч достигают ЗО 1,0 мм в диаметре, Пигмент не выявлен. Пептонный агар "Difco". Колонии кремового цвета, вязкой консистенции, через 24 ч достигают 1,5-2,0 мм в диаметре. $5 Жидкая питательная среда типа Коен-Уилер. Аэробные условия выращивания. Растет при покачивании. Среда 794 г не окрашивается. Микробная взвесь серовато-белого цвета. Физиолого-биохимические признаки. Усваивает .органические соединения. Оптимальная температура роста 33-36 С. В качестве источников азота, углерода и энергии используют аминокислоты.,Используют цитраты. Восстанавливают нитраты в нитриты. Характерна быстрая положительная реакция на уреазу (в течение 30 мин при комнатной температуре). Содержит водоспецифический бронхосептикозный агглютиноген 12. Культура хранится. в лиофильно-высушенном виде. Штамм Bordetel la bronchiseptica4994 содержит эндонуклеазу BbrI, аналог Hind Ш. Пример, Лиофилизированный штамм В.bronchiseptica-4994 высевают на среду КУА с 10Х крови человека с последующим однократным пересевом в пробирки с той же средой, но без добавления крови. После 24 ч инкубирования при 35 С пересевали на матрицы со средой КУА. Микробнме клетки смывали 0,85 -ным раствором хлорида натрия. Микробную суспензию центрифугировали при 7000 g в течение 20 мин при 2-4 С и промывали фосфоцеллюлозньв (PC) буфером (10 мМ фосфата калия, рН 7,0, 1 мМ ЭДТА, 7 мМ меркаптоэтанола). Затем 10 r биомассы суспендировали в 10 мл PC буфера, содержащего 0,4 М NaCl u 100 мкг/мл лизоцима и разрушали Редактор Н;Горькова Техред Ж.Кастелевич Корректор М.Самборская Заказ 2909/6,, Тираж 525. ВНИИПИ Государственного,-- комитета СССР пс делам изобретений и открытий. 113035, Москва„ Ж-35, Раушская наб. д. 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 з 10407 против РС буфера и наносили на колонку фосфоцеллюлозы (PI1 "Whatnan Англия), уравновешенную PC буфером с 0,05 M NaC1, н элюировали 100 мл градиентом 0,05-1,0 M NaCl в PC буфере. Объем каждой. фракции 5 мл. Фракции, содержащие ВЬrI, определя» ли так же, как при хроматографии на голубой сефароэе, фермент элюировался в интервале 0,2-0,25 М NaC1. !О Активные фракции объединяли и диалиэовали против PC буфера, содержащего 0,2 М NaC1 и 507 глицерина. Полученный препарат (3 мл) имел удельную активность 2000 ед/мл. За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг фага М в течение 1 ч. Для идентификации последователь- 2р ности, узнаваемой ВЬгЮ, проводили гидролиз ею ДНК фагаЛ, плазмид pBR322 и pSGI (несущей полный ге- ном $Ч40). Параллельно. проводили гидролиз указанньм тесторных ЛНК д 94 4 эндонуклеазой Hind Ш. Электрофореэ продуктов гидролиза в агаровньщ и полиакриламидных гелях показал, что BbrI гндролизует каждую из тесторньм ЛНК на фрагменты, полностью идентичные Hind III-специфическим фрагментам. Следовательно, последователь1 ность нуклеотидов, узнаваемая BbrI, идентична последовательности нуклеотидов, узнаваемой Hind III. В результате обработки BbrI-фрагментов ДНК 5, Т4 ДНК-лигазой так же, как и в случае Hind 1??-фрагментов ДНК Л, приблизительно 90Х материала превращалось в высокомолекулярную форму. Следовательно, так же, как и в случае Hind XII-фрагментов, BbrI-фрагменты ДНК имеют однонитевые. липкие концы Таким образом, рестриктаза BbrI имеет сайт узнавания ААС СТТ, идентичный сайту узнавания прототипа Hind.III, и может полностью заменить прототип во всех генно-инженерных экспериментах.
