Способ получения водорастворимого иммобилизованного протеолитического комплекса

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

09) (11) 3(50 «2 М 11/10

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСНОМ Ф СВИДЕТЕЛЬСТВ/

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3340238/28-13 (22) 16,.09.81 (46) 15.09.83 Бюл. Р 3 (72) В.С. Чудар, С.Я. Перконе, А.К. Арен, С.П. Скуя, Ю.Ю. Каткевич и P. Ã. Каткевич (53) 577. 15(088. 8) (56) 1. Иммобилизованные. ферменты.

Под. ред, И.В. Березина, В.Н. Антонова и К, Мартинена. Т . 1, М ., Изд-во, МГУ, 1976, с. 181-185.

2. Авторское свидетельство СССР

У 730694, кл. С 08 В 37/02, 1976 (прототип), (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПРОТЕО"

ЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА, включающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента, о т л,и ч а " ю шийся тем, что, с целью повышения активности иммобилизованного протеолитического комплекса и упрощения способа, в качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буфере рН 8,05, а присоединение: фермента осуществляют при соотношении носитель:фермент 1: -3.

1 1041

Изобретение относится к получению высокомолекулярных соединений, обладающих ферментативной активностью, находящих прйменение в химической, биохимической промышленности, а также в медицине и для научных целей.

Известны способы иммобилизации протеолитических ферментов через

NH<-группы на носителях с альдегидными группировками (1) .

Недостатки этих способов - снижение ферментативной активности после иммобилизации, необходимость использования синтетических носителей или пред варительно акти вированных для 15 получения альдегидных групп - природных носителей.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому аффекту является способ получе- 20 ния водорастворимого иимобилизованного протеолитического комплекса, включающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоеди- 25 нение фермента (21.

Согласно прототипу носителем служат производные декстранов с мол. массой 20-110 тысяч, окисленные до степени окисления 11 =6-483, а в качестве фермента использован про" теолитический фермент террилитин.

Взаимодействие декстрана с террилитином осуществляют в водном буферном растворе при рН 7,5-10,0, температуре 15-250С в течение 15- 180 мин при соотношении реагентов в реакционной смеси (декстран и фермент) от 1-0.1-0 9 °

Биокатализатор (стабилизированный декстраном террилитин) получают в двух последовательных стадиях: активация декстранов s реакции перио датного окисления (степень окисления матрицы (=6-483), связывание фермента а окисленным декстраном.

Этот процесс проводят следующим образом. 165 мг декстрана, окисленного до степени окисления g =24,, с мол. массой 20 тысяч и растворенного в 3,6 мл воды (концентрация полимера 50 мг/мл) смешивают с

4„9 мл раствора фермента в 0,1 М боратном буфере рН 8,5. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 21 1.С и рН 8,5, Затем добавля0 ют 1 мл О, 1 И раствора боратного буфера, содержащего 40 мг боргидри567 2 да натрия и перемешивают при 21+1+C в течение 40 мин.

Полученный препарат, связанный с ферментом декст.ран, диализуют на холоде (М2 С) против дистиллированной воды в течение 48 ч. После этого при помощи гельфильтрации отделяют избыток несвязанного фермента. Полученный препарат высушивают лиофильно известным способом. Выход продукта 235 мг сухого препарата, Удельная активность 7,4 ПЕ/мг. Общая ° активность препарата 1740 ПЕ °

Выход продукта от введенной энзимат, активности 1003.

Недостатки известного способадефицитный и дорогостоящий носительдекстран, сравнительно низкая удельная и общая активность в процессе стабилизирования не увеличивается перво" начальная активность энзима), слож ность процесса (длительный процесс активизирования матрицы, значительные затраты времени, энергетических ресурсов и cblpbR) неоднородность матрицы (мол. масса колеблется в пределах 20-220 тысяч) .

Цель изобретения — повышение активности иммобилизованного протеолитического комплекса и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения водораствориыого иммобилизованного протеолитического комплекса, включающему растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента, в качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трис"

-оксиметиламинометановом буфере рН 8,05, а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель:фермент 1:1-3.

В предлагаемом способе в качестве матрицы используют качественно новый носитель-ксилоуронид, изолированный из лигнифицированного растительного материала, например древесины, отхо» дов сельскохозяйственной и деревообрабатывающей промышленности. Ксилоуронид образуется в больших количест" вах в процессе сульфатной варки целлюлозы из лингифицированного растительного материала как побочный продукт, а также может быть получен и прямой экстракцией холоцеллюлозы, разбавленз 1041 ной щелочью. Положительным фактором является однородность ксилоуронида, мол. масса последнего колеблется в пределах 16-13 тысяч.

Иатрица характеризуется следую щими показателями:

Степень полинеризации (Сп) 110-130

Иол . масса, Дальтон 16000- 18000

Количество активных !О альдегидных групп, мгЕ г препарата

Таким образом, в качестве носите" ° ля используют дешевый и доступный . 15 ксилоуронид.

Процесс присоединения фермента к носителю происходит при взаимодействии карбонильных групп полимера матрицы) и аминогрупп остатков лизи" 2О на фермента. Схематически реакцию иммобилизации можно изобразить в следующем виде:

ТРИС. рН 8-9 rrw-+

К-С +Ф-NH ----- ------- К-С

218-20 С Н где К - ксилоуронид;

Ф " фермент.

Реакцию проводят в мягких условиях при 18-20ОС и в 0,1 И трис-оксииетиламинометановом буферном растворе рН 8,65, так как оптимум действия ферментного комплекса расположен при указанном значении рН.

Согласно способу получения водорастворимого стабилизированного пре" парата протеолитического ферментного комплекса осуществляют ковалентное связывание полимера с ферментом при соотношении носитель Фермент 1:1-3 ° : 4О

При этом количество. взятого энзима превосходит количество матрицы. Иножество активных.альдегидных,групп носителя при низких концентрациях фермента может реагировать не толь- 4 ко с реакционно способными группами на поверхности ферментного комплекса, но и с тат<овыми в активным центрах фермента. Когда же фермента много, альдегидные группы матрицы преимущественно реагируют с аминными группа. ми на поверхности ферментного комплекса, не затрагивая актиBHblx центров фермента, благодаря этому обеспечивается высокая активность пре55 парата.

Учитывая, что процесс иммобилизации стабилизации) фермента осуще-.------г----»Г

Активность фермента, r

Время

Иммобилизованный

Свободный

100

0 ч

100

101,10

2 ч

101 9

102,7

15 сут

30 сут

110

120

Пример 1. 0 05 г ксилоурони-, да .растворяют в 12 мл 0,1 M трис-оксиметиламинометановом буферном растворе рН 8,05.Растворяют на магнитной мешалке 15мин при 20С.К раствору ксилоуронида добавляют 0,05 г протеолитического ферментного комплекса, полученного из Азрегц! l 1 us aruzal КС. (соотношение носителя и фермента 1:1) смесь перемешивают в течение 10 мин о и выдерживают сутки при 20 С. СтабилиР зированный препарат хранят при 0-4 С.

567 4 ствляется при рН 8 05, а дальнейшее использование стабилизированного фермента происходит при рН 8, азоме" тиновая связь как при хранении биокатализатора, так и при работе.

Способ осуществляют следующим образом.

Ксилоуронид растворяют в 0,1 М трис-оксиметиламино метановом буферном растворе, рН 8,05 в течение 10О

15 мин -при перемешивании при 18-20 С.

Растворймый комплекс полимеро-фермент, например протеолитическйй ферментный комплекс, получают добавлением фермента к раствору ксилоуронида при соотношении носитель:Фер мент 1:1-3 с последующим перемешиванием в течение 5-10 мин и выдержкой

r. смесипри 18-20 Св течение 24 ч.Полученный предложенным способом водорастворимый комплекс фермента-полимера через 24 ч обладает активностью

140, 5-460,0r от исходной активности, а через 30 сут остаточная активность 107,1-347,63 от исходной активности, В таблице показано стабилизирующее действие ксилоуронида. че ез 30 с, 14763,9 мкиоль тиРозина г белка мин т.е. 347,6> от исходной, Пример 3, 0 05 г ксилоуронида растворяют в 12 мл 0,1 М трис-оксиметиламиновом буферном растворе, рН 8,05. Растворяют на магнитной ме- шалке 12 мин при комнатной температуре. К раствору добавляют 0,15 r протеолитического ферментного комплекса, полученного из Aspergillus aryzal КС (соотношения носителя и Фермента 1:3)

Выдерживают 24 ч при 20 С. Хранят

О стабилизированный препарат при +4 С.

Активность через 24 ч 13689,4 мкМоль тиРозина е 322 3О от г белка.мин исходной через 30 сут 14343,4 мкМоль тирозина е 337 7

r белка мин ходной.

Использование изобретения обеспе" чивает увеличение активности биокатализатора в 2-4 раза по сравнению с прототипом и сохранение ее без существенных изменений в течение

30 сут (см. таблицу), упрощение процесса - исключается стадия активации матрицы. Кроме того, сокращается время иммобилизации и достигается экономия электроэнергии и материалов.

- 5 1041567

Активность через 24 ч 5967,5 мкйоль тиРози а т.е. 140,53 от исходной, чеРез 45" 9 г белка 1мин

5 т.е. 107,13 от исходной.

Активность иммобилизованного протеолитического ферментного комплекса определяется по модифицированному методу Ансона. 10

За единицу протеолитической активности иммобилизованного протеолити" ческого комплекса принято т кое количество связанного препарата, кото" рое за минуту при температуре 37 С и

0 рН 8,0 катализирует превращение субстрата (казеина) в неосаждаемое с ТХУ (т ри-хлору ксусной кислотой ) состояние, содержащее один микро-» моль тирозина. 20

Пример 2. 0 05 г ксилоуронида растворяют в 12 мл 0,1 М трис-оксиметиламинометановом буферном растворе рН 8,05. Растворяют йа магнитной мешалке 10 мин при 18 С. К рас-25 — а твору ксилоуронида добавляют 0,125 г протеолитического Ферментного комплек"са, полученного из Aspergi1ius агуиа1 КС (соотношение носителя и . фермента 1:2,5) . Выдерживают 24 ч при 180С, Хранят стабилизированный препарат при +4 C.

Активность через 24 часа 19538,0

МКМоль ти ози.а е 4603 исхор ой, .г белка,.мин

Составитель И.Привалова

Реаактое «В Ковтун Texi.eg A». Áàáèíe КОИекто2 СЛекмар

Заказ 7065/24 Тираж 523 Подпйсное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

«1«1)0)g Москва ЖЦ Ра шская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4