Способ определения активности лизирующих ферментов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛМЗИРУЮЦИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматриваклций подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизиругадего фермента, для поддержания заданного значения рН и измерение скорости подачи тИтранта в реакционную смесь, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности, предварительно перед получением реакционной смеси раздельно нейтрализуют раствор лизирующего фермента и субстрат до заданного значения рН путем подачи титранта и измеряют скорость подачи последнего ,в субстрат, вводят раствор лизирукидего фермента в субстрат для получения реакционной смеси при достижении скорости подачи титранта в субстрат постоянного значения, а определение активности лизирую (Л щих ферментов осуществляют по разности скоростей подачи титранта в реакционную смесь и в субстрат.

СООЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (10 (59 С 12 3/00.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОИ:НОМУ СВИДЕ"П":ЛЬС3;ВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 ) 3334679/28-13 (22) .05.08.81 (46 ) 15 ° 09. 83. Бюл. 9 34 (72) С.Л. Григишкас, A.Ï. Шпокене, У.Э. Виестур, Э-В.В. Башкис., Г.Б. Герасимене, A.Ï. Ужкуренас и A.Á. Паулюконис (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энэимологии (53) 577.15(088.8) (56) 1. Su@imari.Т., ОсЬ168, Tsukada J. Method of the determine.

Agr. Biol . Chem, 1972, .Р 36, р, 669»

2.Определение фосфьполипазной ак.тивности методом потенциометрического титрования при постоянном значении юН.- "Лабораторное дело", 1978, 9 4 с. 217-220. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВ-

НОСТИ ЛИЗИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ, предус- матривающий подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизнрующего фермента, для поддержания заданного значения рН н измерение скорости подачи титранта в реакционную смесь, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности, предварительно перед получением реакционной смеси раздельно нейтрализуют раствор лизирующего фермента и субстрат.до заданного значения рН путем подачи титранта и измеряют скорость подачи последнего .в субстрат, вводят раствор лизирующего фермента в субстрат для получения реакционной смеси при достижении скорости подачи титранта в субстрат постоянного значения,,р

Р а определение активности лизирувших ферментов осуществляют по разности скоростей подачи титранта в реакционную смесь и в субстрат.

1041569

Изобретение относится к микробио логической промыыпенности, а именно к способам определения активности ферментов, обладающих способностью лиэировать клеточные стенки микроорганизмов.

Известен турэодиметрический способ определения активности лизирующих ферментов путем определения оптической плотности суспенэии испытуемого субстрата до и после воздействия ферментов (1) .

Недостатком данного способа является значительная длительность определения активности лизирующих ферментов.

Известен также способ определения активности лизирующих ферментов, предусматривающий подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизирующего фермента, для поддержания заданного значения рН и измерение скорости подачи титранта в реакционную смесь (2) .

Однако известный способ не обеспечивает получения точного результата, так как не учитывает влияния автолиза субстрата. Кроме того, измерение активности проводится в атмосфере азота, что усложняет процесс измерения и практически способ трудно применим для экспрессанализов.

Цель изобретения — повышение точности определения активности лизирующих ферментов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности лизирующих ферментов, предусматривающему подачу титранта в реакционную смесь, содержащую субстрат и раствор лизирующего фермента, для поддержания заданного значения рН и измерение скорости подачи титранта в реакционную смесь, предварительно перед получением реакционной смеси раздельно нейтрализуют раствор лизирующего фермента и субстрат до заданного значения рН путем подачи титранта и измеряют скорость подачи последнего в субстрат, вводят раствор лизирующего фермента в субстрат для получения реакционной смеси при достижении скорости подачи титранта в субстрат постоянного значения, а определение. активности лизирующих ферментов осуществляют по разности скоростей подачи титранта в реакционную смесь и в субстрат.

На фиг. 1 изображена принципиальная схема установки рН-стата; на ф 2 †. кривая титрования, где по фиг. ин оси абсцисс отложено время в м утах, а а по оси ординат — показания прибора в миллиметрах.

Для автоматического измерения активности лизирующих ферментов используют установку рН-стата с автоматическим регистрированием кривых титрования (фйг, 1).

5 Установка рН-стата включает термостатированную ультратермостатом УТ-10 кювету 1, смонтированную над магнитной мешалкой 2, в которую вставлены электроды 3, соединенные с универ1(} сальным ионометром типа 3В-74 4, с которого. сигнал, полученный от электродов 3, подается на блок автоматического титрования типа BAT-15 5 и далее на автоматическую бюреткудозатор типа Б-701 6. Автоматическая .бюретка-дозатор 6 через блок дифференцирования 7 связана с самописцем типа КСП-4 8.

Пример 1. Определение лизирующей активности дрожжелитического ферментного препарата ГЗх.

В 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,2 r дрожжелитического ферментного препарата ГЗх. рН ферментного раствора доводят до значения рН = 8,1 при помощи 0,1 и КОН.

В качестве субстрата используют суспензию дрожжей Candida util is, выращенных на сульфитных щелоках.

4 r сухих дрожжей заливают 100 мп

30 дистиллированной воды и 1 мл 0,4Ъного раствора мертнолята для предотвращения роста посторонней микрофлоры и термостатируют в суховоздушном термостате в течение 24 ч

35 при 37 С. В термостатированную кювету (при 40 С ) объемом 14 мл наливают 8 мл ранее приготовленного субстрата и выдерживают 3 мин до дос. тижения заданной температуры.

При тщательном перемешивании рН субстрата доводят до 8,1 (1 и КОН ) и измеряют скорость антолиза субстра-. та. Для этого включают самописец, автоматическую бюретку и блок дифференцирования. При помощи самописца

45 записывают скорость подачи титран та 0,035 М KOH из бюретки в кювету 1.

Достигнутая постоянная скорость подачи титранта в процессе автолиза субстрата (при рН 8,1) изображена кривой титрования аб (фиг. 2).

После этого в ту же кювету вводят 2 мл ферментного раствора и продолжают титрование, и записывают скорость подачи титранта, используе55 мого для нейтрализации образовавшихся кислотных эквивалентрв в процессе ферментной реакции.

По истечении 10-15 мин титрования достигают постоянную скорость подачй

60 титранта и процесс останавливают путем выключения бюретки, самописца и блока дифференцирования.

Ферментная реакция соответствует участку кривой титрования вг (фиг. 2), 1041569

3 О 152

0,228 ед/мл

Чисно

onреде.нвиий

Х

Дисперсия, S

Способ

Лизирующая активность, Рд/Г! ед/мп

Коэффициент, вариации

V-=- 100

S а

Культуральная жидкость

S. à !bus 176

Ферментный пре-. парат

Предлагаемый

1,3

10,732

252

6,76

3, 334

0,000049

1,3

200

10

0,661

1,2

Для подсчета активности фермента определяют титр используемой щелочи, выраженной в микрограмм-эквивалентах на 1 мм (Т мкг-экв ОН

). В кюмм вету наливают 10 мл 1 М КС1, устанав- 5 ливают рН 8,1 и при перемешивании добавляют 0 5 мл 0,01 и HCl, что равняется 5 10 6 r-экв кислоты. При недвижущейся бумаге самописца оттитровывают введенную кислоту до заданного значения рн (8,1), при этом регистрируют расстояние в миллиметрах,. пройденное пером самописца Т=0,152,.

Активность лизирующего ферментного препарата определяют по формуле

Т(tg« tg «2) K

Ю

190 ед/г, О, 152 (6-1 ) 500 190 где Т вЂ” титр используемой щелочи;

MM — — угол наклона кривой титромин вания при ферментативной: реакции; мин — угол наклона кривой титрования при самопроизвольном гидролизе субстрата; — объем внесенного в субстрат ферментного раствора, (глп)р

К вЂ” разведение. 30

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое выделяет 1.мкмоль титруемых щелочьюкислот в 1 мин.

Пример 2. Определение ли.- 35 зирующей активности культуральной жидкости S tr e p t o my ces а! bu s 176.

Ферментогл служит неразведенная: культураль ная жидкость S tr е р to my ce s а lbus 176. рН культуральной жидкости 40 доводят до 8,5 при поглощи 0,1 и КОН.

В качестве субстрата используют дрожки Candida qui 11 iermo ndi i, Ход приготовления субстрата по примеру 1. В терглостатированную: кювету при 45ОС объемом 14 мл нали-, вают 8 мл ранее приготовленного субстрата и выдерживают 3 мин до достижении. заданной температуры.

При тщательном перемешивании рН, субстрата доводят до 8,5 (1 и KOH) и измеряют скорость автолиза субстрата. Температура и рН проведе- ния реакции подобраны оптимальными для действия данного фермента на . субстрат. Ход определения лизирующей активности по примеру 1. Скорость автолиза субстрата С.qui lliermo nd,i i tg« = 1 мм/мин.. Скорость ферментной реакции tg«, = 4 мм/мин. Лизирующая активность культуральной жидкости S. а!bus 176, вычислена по формуле,.указанной в примере 1.

При проверке достоверности определения проведены сравнительные испытания по определению лизирующей активности ферментных препаратов и культуральной жидкости S. al bus 176.

В таблице приведены результаты =pox серий определения активности лиэирующих ферментных препаратов на субстрат дрожжи Candida uti lis и трех серий определений активности с использованием культуральиой жидкости

S. a! bus 176 на субстрат дрожжи

Сапд da.oui lliermondii..

Как видно из приведенных дайггых разброс результатов в параллельных определениях активности лизирующих ферментов соответствует среднему значению коэффициента вариации — 1,33% для предлагаемого метода и 1,93% для метода по прототипу (вьиае известного на 0,7%).

Годовой экономический эффект при внедрении предлагаемого изобретения

12000 руб. в год.

1041569

Продолженив таблицы

Способ

Ферментный препарат

1,2

0,322 0,000014

0,261 0,000011

1,3

Известный

1,8

274

1,8

232

1 9

188

10

2,1

2,2

1,8

Культуральная жидкость

S. slut s

1 6

Число определений

Лизирующая активность, ед/гу ед/мл

0,811

О, 4 51

О, 311

Дисперсия., S

24,3246

17,434

12,759

0,000289

0,000098

0,000031

Коэффициент вариации

v-=- 100

S а

1041569

О имя юк.

Составитель Н. Арцыбашева

Редактор В. Ковтун. ТехредМ.Гергель

Корректор И.Ватрушкина

Заказ 7066/27 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-.35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г; Ужгород, ул. Проектная, 4