Способ выделения фактора роста нервной ткани из змеиного яда

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФАКТОРА РОСТА НЕРВНОЙ ТКАНИ ИЗ ЗМЕИНОГО ЯДА, предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием гельфильтра; цию полученной «адосадочной жидкости на сефадексе в присутствии буферного раствора и ионообменную хроматографию с использование элюента с повышающейся ионной силой, о т л и - . чаю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве исходного используют яд гюрзы, гельфильтрацию осуществляют на сефадексе G-100, ионообменную хроматографию - , на колонке с карбоксиметилцеллюлрзой, в качестве буферного раствора в процессе используют 0,19-0,21 М раствор уксуснокислого аммония с рН 6,4-6,6, а в качестве элюента используют указанный радтвор в градиенте кон центрации от 0,19-0,21 до 0,95 1 ,05 м;

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР . Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ И3ОБРЕТЕНИЯ . К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ,Ф к (21) 3417689/28-13 (22)31 ° 03 ° 82 (46) 23.11.83 Бюл. Р 43 (72) Э.П. Сийгур, В.Ю.Ярве, A,A.Tapa и Ю.Р.Снйгур (71) Институт химической и биологической физики AH ЭсТонской CCP и Опытный завод органического син.теза и биопрепаратов Института Химии

AH Эстонской ССР (53) 547.95 (088.8.) (56) 1. Angeletti R Н., Bradshaw R..А.

Nerve Yrowth factor from mouse .sub-.

maxillary gland, ami noae i d sequence.-

Proc naf n.. эсад а Sc i ° Ua .S °, 1971 р

68 б 2417-2 420.

2. Bocchin Ч. The Nerve Yrowth

Factor, Aminoacid composition and

phisicochemical properties. — Eur.J

B i o c h em, 1970, 15, 127-131..

3. Реаrce F.Ь. et al .The isolat ion and charactheri sat ion of

Nerve Yrowth Factor from the venom

of Vipers russelli, in Nerve growth

Factor and its Ant i serum (Ed it ed

by Zainus E). London 1972, 3-18 °

4. Bailey J,S. et al. А comparative study of nerve growth factors

from suake venoms,-Comp. Biochem, Physiol ° 1975, Ч 51, В, 429-438.

5.Levi-Nontalcini R. et al,.

"Cancer Res", 1954, 14 49-57 °

3(59 С 07 С 7 06/ A 61 К 35 58 (54) (57) СПОСОБ БЦЦЕЭ1ЕНИЯ ФАКТОРА

РОСТА НЕРВНОЙ ТКАНИ И3 ЗМЕИНОГО

ЯцА,.предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию полученной надосадочной жидкости; на сефадексе в присутствии буферного раствора и ионообменную хроматографию с использованием элюента с повышающейся ионной силой, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и повьааения выхода целевого продукта, в качестве исходного используют яд гюрзы, гельфильтрацию осуществляют на сефадексе

Q-100, ионообменную хроматографию— на колонке с карбоксиметилцеллюлозойЯ в качестве буферного раствора в процессе используют 0,19-0,21 М раствор уксусаокаслого аккаоаиа с ра б, б-б,б, а в качестве элюента используют укаэанный раствор в градиенте. кон центрации от 0,19-0,21 до 0,95 - ф

1,05 М.

1055732

Изобретение относится к промышленности биоактивных веществ и представляет собой способ получения фактора роста нервной ткани (ФРНТ) из яда гюрзы, усиливающего рост и дифференцировку симпатических и эмбрио- 5 нальных сейсорных нервных клеток.

Введение CPHT животному, начиная с первого дня рождения, вызывает гипертрофию симпатической нервной системы, а сенсорные клетки чувствитель- 10 ны к.ФРНТ только в эмбриональном периоде. ФРНТ используется для исследовательских .раьот, а также может быть использован B медицине, Известны способы выделения ФРНТ 15 из тканей животных (слюнная железа миаи, плацента $1)., сердце и др. (2)) и биологических жидкостей животных, например змеиных ядов 13) .

Получение ФРНТ из тканей животных очень трудоемко и не обеспечивает чистоту продукта, так как источники препарата прецставляют собой многакомпонентную смесь различных белковых и небелкавых компонентов„ разделение которых является сложной задачей.. Наиболее эффективным истоЧником ФРНТ являются змеиные яды, которые содержат только белковые компоненты и имеют стабильный состав.

ФРНТ обранужен в ядах представителей всех семейств змей (4

В некоторых ядах определение начальной концентрации ФРНТ невозможно из-.за содержания в них высоко- 5 токсичных компонентов (например в яде кббры). Обычно яды элапидов и виперидов имеют более сильную активность ФРНТ, чем яды кроталидов.

Состав яда различных змей варьи 4О рует, это .связано с видовой специфичностью ядав, а также с местом обитания и условиями существования..

В связи с этим получение CPHT методами, разработанными на ядах одних змей, не пригодно при работе с ядами других. Способ выделения ФРНТ из ядов среднеазиатских змей не известен.

Наиьолее близким к изобретению по технической сущности является способ выделения фактора роста нервной ткани из яда песчаной гадюки. (Vipera ammodytes ammodytes), предусматривающий растворение яда в буферном растворе - 0,1 N растворе муравьинокислого аммония (рН 4,7) с последующим центрифугированием, гельфильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе Cj --50 в 66 присутствий того же буферного раствора, обессаливание, высушивание и растворение в 0,08 М трис-цитрат- ., нам ьуфере, рН 7,3 и ионооьменную хроматографию на колонке с СЭ-сефадексомЦ -25 с использованием элюента с повышающейся ионной силой - линейного градиента 0,5 М NaC1 + 0,5 М трис-цитратного буфера (pH 7,3), B заключение проводят препаративную иэоэлектрическую фокусировку в интер-вале рН 7-10.

Получают препарат ФРНТ с биологической активностью 5"10 мг/мл и выходом 0;05% (4) .

Оцнако применение разных буферных систем на каждом этапе очистки вызы" вает необходимость трудоемких операций обессоливания между этапами, применение буферных систем из нелетучих компонентов при лиофилизации вызывает необходимоСть обессолива.ния, применение этапа препаративнай изоэлектрической фокусировки треьует наличия дорогой импортной аппаратуры и дорогих импортных амфалитов (рН

7-10).

Кроме того, недостатком способа является низкйй выход препарата (0,05%) .

Цель изоьретения — упрощение способа и повышение выхода препарата ФРНТ.

Поставленная цель .достигается тем, чта согласно способу выцеления фактора раста нервной ткани из змеиного яда, предусматривающему растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гельфильтрацию полученной надасадочной жидкости на сефадексе в присутствии буферного раствора и ионообменную хроматографию с использованием элюента с повыыающейся ионной силой, в качестве исходного используют яд

Гюрзы, гельфильтрацию осуществляют на сефадексе б -100, ианообменную хроматографию — на колонке с карбоксиметилцеллюлозой, в качестве буферного раствора в процессе используют

0,19-0,21 М раствор уксуснокислого аммония с рН b 4-b,b, а в качестве элюента используют указанный раствор в градиенте концентрации ат 0,19

0,21 да 0,95 — 1,05 М.

Изобретение обеспечивает упроще— ние способа за счет исключения ряда стадий (иэоэлектрофокусировки, обессоливания)и проведения процесса в одном ьуфере. При этом выход целевого продукта повышается до 30 раз.

Ы качестве буфера. используют раствор уксуснокислого аммония с молярностью 0,19-0,21 М, рН 6,4-6,6 и удельной электропроводностью (14,5

15,5) . 10 p сю-1, а в качестве элюента используют линейный градиент из растворов уксуснокислого аммония

0,19-0,21 и 0,95-1,05 N с удельными электропровадностями растворов (14,4 - 15,5) 10 P c9 и (Ь 3-65)

10 Р сЮ (рН 6,5-6,6), соответственно.

1055732

Аммоний уксуснокислый является очень гигроскопическим веществом и с целью приготовления хорошо воспроизводимых буферных растворов необходим контроль ионной силы раствора, а самым удобным методом является кондуктометрический метод. Удельная электропроводность расчитывается по формуле

К

ЧЭ= (р сщ j!

О где К - константа ячейки кондуктО-: метра, См- ;

Р— сопротивление раствора Ом.

Использование уксуснокислого аммония в качестве буфера на стадии растворения яда обеспечивает создание среды для последующего разделе» ния. Гельфильтрации подвергают раствор яда гюрзы, разделение происходит 20 на геле, причем в качестве геля ис- пользуется сверхтонкий еефадекс

5-100, разделяющий белки в пределах молекулярного веса 4000-150000

,дальтон. Jar, гюрзы, содержащии мно- 25 гокомпонентную смесь разделяется: на 9 белковых пиков, I-lll u V-1Х пики в которых присутствуют протеазы, нуклеазы, К -аминооксидаза, и другие вещества, исключаются. 30

Степень. очистки — 5-6 раз.

Последующей ионообменной хроматографии подвергают фракции 1 V пика гельФильтрации. В качестве ионита используют избирательно 35 действующую карбоксиметилцеллюлозу и проводят селективное разделение.

На ионит наносят раствор ФРНТ с удельной электропроводностью (14,5

15,5)" 10 p см (РН б»4-6»б). При 40 этом основная часть белка проходит ионообмеиник, а ФРНТ связывается на катионит, который элюируют линейным градиентом ионной силы.

Такйм образом, предлагаемый

4$ способ заключается в следующем: яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония (0,19-0,21 M} с удельной электропроводностью (14,5

15,5) ° 10 р см- (рН 6,4-6,6), центрифугируют,осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. Гельфильтрацию проводят на сверхтонком сефадексе

9-100 с раствором 0 19-0,21 И уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью (14,5-15,5)- 10 .см ь (рН 6,4-6,6). Полученная фракция

ФРНТ с приблизительно одинаковым молекулярным весом наносят непосредственно на колонку карбоксиметил- 60 целлюлозы. Основная часть белка проходит катионит, а ФРНТ связывается на карбокснметилцеллюлозу при рН

6,4-6,6 и удельной электропроводности раствора (14,5 — 15,5) Й см, Выход по активности,Ъ

Биологическая актив

М.

98,0 элюируют линейным градиентом ионной силой раствора уксуснокислого аммония (0,19-0, 21) †(0,95-1,05 М) с удельной электропроводностью (14,5—

15,5.)» 10 - (63-65) 10 () ° см (pH 6,46,6 ). Фракции ФРНТ собирают и высушивают при помощи лиофилизации.

Выхо 1,5% биологическая активность

5> 10 мг/мп.

Пример 1. К 4,9 г яда гюр-. зы добавляют 35 мп 0,19 M раствора уксуснОкислого аммония с. удельной электропроводностью 14,5<10 ð см (рН 6,4), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4 С. Растворенный яд центрифугируют при

5006 об/мин при 4 С в течение

30 мин Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 14,5 10 ф см колонку со-сверхтонким сефадексом

g-100 (размер колонки 4,2i140 cM) наносят раствор яда.

Колонку элюируют раствором укоуснокислого аммония с удельной электропроводностью 14, 5 10фсм (рН б, 4) со скоростью 13 мл/ч и собирают фракциИ по 19 мл.. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорда-11". Получают 9 белковых пиков. В 1 V пике фракции, которые имеют биологичес« кую активность ФРНТ, объединяют (объем 193 мл) . . Раствор ФРНТ наносят на уравновешенную раствором 0,19 M уксуснокислого аммония удельной электропроводности 14>5 ° 10 р см (рН 6,4) колонку карбоксиметилцеллюлозы

KN-52. через колонку пропускают

0,5 л . 0,19 И раствора уксуснокислого аммония удельной электро-. проводности 14,5 ° 10 p см (рН 6,4) .

Скорость элюции 45 мл/ч, собираются фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют не;прерывно с помощью "увикорда". Основная часть белка проходит катионит в данных условиях, а ФРНТ» имеющий изоэлектрическую точку выше

8,5, связывается на катионит KN«52. и его элюируют линейным градиентом ионной силы уксуснокислого аммония от (0,19 M) удельной электропроводностй 14,5 р см- (500 мл) до (0,95 И) 63 10 р»см (500 мл) (рН 6,4) .

Фракции, содержащие биологическую активность ФРНТ, объединяют (выход .

605 мл) и высушивают лиофильно.

Характеристика препарата:

Выход, мг 76,56 мг (1,56% по белку) .

1055732

50

64,5

Пример 3. К 5 1 г яда гюрзы добавляют 36 мл 0,21 М раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 10" р.см (рН 6,6), смесь медленно перемешивают в течение 4 ч. Растворенный 65 ность, 5 10 мг/мл

Степень очистки, раз 64,0

Пример 2. К 5 0 r яда гюрзы добавляют 35 .мл 0,2 М раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,0 10 g см (pH 6,5) . Смесь медленно перемешивают в течение 4 ч, Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4 С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную 0,2 M раствором уксуснокислого аммония .(Удельная электропроводность 15,0 10 (: см колок- l5 ку со сверхтонким сефадексом Q -100 с размером колонки 4,2 140 см наносят раствор яда. Колонку элюируют раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15.,0 ° 20

10 ð,см (рН 6,5) со скоростью 13мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорба-11". Получают 9 белковых пиков, В V пике фракции, которые имеют биологическую активность ФРНТ, объединяют (Ьбъем 190 мл) .

Раствор ФРНТ наносят на уравновешенную раствором уксуснокислого аммония с удельной электропровод-.. ностью 15,0 10 P,см (рН 6,5) колонку КИ-52. Через колонку пропускают

0,5 л раствора уксуснокислого аммония (рН 6,5) с удельной электро-: 35 проводностью 15,0 ° 10 р. см 1. Скорость элюции 45 мл/ч, собираются фракции по 15 мл. Оптичес1<ую плот— ность элюата регистрируют непрерыв. но с помощью "Увикорда". Белки, связывающиеся íà KM-52 в данных условиях, элюируют линейным градиентом ионной силы 0,2»1,0 И уксуснокислого аммония от удельной электропроводности раствора .15,0 10 (.см 1 (500 мл) до 64,0 10 ð см" 45 (500 мл) при рН 6,5. Фракции, содержащие биологическую активность

ФРНТ, объединяют (выход 588 мл)и высушивают лиофкльно.

Характеристика препарата:

Выход,мл 77,52 (1,55% по белку) .

Выход по активности,В 98,2

Биологическая 55 актив ность, мг/мл 5 10

Степень очист.ки, раз яд центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, при 4 С. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. На уравновешенную. 0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 10 р см колонку.со сверхтонким сефадексом

G-100 с размером колонки 4,2 140 см наносят раствор яда. Колонку элюируют 0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15, 5 ° 10 р см (pH б, 6) со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции по 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируЮт непрерывно с помощью "Увикорда-11". Получают 9 белковых пиков. В IV пике фракции, которые имек1т биологическую активность ФРНТ, объединяют (объем 196 мл1.

Раствор ФРНТ наносят на уравновешенную 0,21 М раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 10 р см i(pH б,б) колонку КМ-52. Через колонку пропускают 0,5 л 0,21 М раствора уксуснокислого аммония (рН 6,6) с удельной электропроводностью 15,5 10" р-см

Скорость элюации 45 мл/ч, собирают фракции по 15 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорда". Белки, свяэывающиеся яа КМ-52 в данных условиях, элюируют линейным градиентом ионной силы уксуснокислого аммония (1,05 М) от удельной электропроводности раствора 15,5 ° 10 р см r(500мл) до 65, 0"10 .см 550 мп при рН 6 6.

Фракции, содержащие биологическую активность ФРНТ, объединяют . (выход 393 мл) и высушивают лиофильно. ФРНТ элюируется в данных условиях в первом пике градиента и разделяется от протеолитического фермента, имеющего более высокую рН, чем CPHT.

Характеристика препарата:

Выход, мг 79,9 (1,57% по белку)

Выход по активности, Ъ 98,0

Биологическая активность, Mr/мл. 6 10

Степень очистки, раз 63,8

Лиофилизованный препарат ФРНТ полностью сохраняет биологическую активность в течение 24 мес. при хранении при 4ОС.

Определение биологической активности ФРНТ выполняют по извест-ной методике (Я .

Биологическую активность ФРНТ определяют с помощью культуры сенсорных ганглиев 8-дневного куриного эмбриона, наблюдая радиаль ный рост аксонов от ганглия.

1055732. Составитель О.Скородумова

Редактор Г.Безвершенко Техред A.Áàáèíåö

Корректор

Заказ 9232/20 Тираж 418

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал IIIIII "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Сенсорные ганглии куриного эмбриона помещают в 3 мл раствора, состоящего из 10% сыворотки крови в культуральной среде 9 199, 300 единиц пенициллина и стрептомицина и 0,01-0,05 мл исследуемой пробы, растворенной в этом же растворе, Пробу инкубируют в течение 18-24 ч при 37 С. При наличии в растворе ФРНТ можно наблюдать радиальный рост аксонов от ганглия. В зависимости 10 от плотности и ширины образовавшегося венца положительный ответ на присутствие ФРНТ оцейивают но 5-бал .— ной шкале.

За биологическую активность ФРНТ принимают ту минимальную концентрацию препарата в культуральной среде, которая вызывает "+3" — ответ сенсорных ганглиев за 18 ч инкубации по 5-бальной шкале.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в экономии змеиного яда за счет увеличения выхода препарата ФРНТ. При этом упрощается процесс очистки ФРНТ из яда гюрзы.