Способ получения биоспецифического сорбента

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИдаЧЕСКОГО СОРБЕНТА путем связывания лиганда на основе уридина с носителем , отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения химической стойкости сорбента, в качестве лиганда используют 5-оксиуридин ) Б дифосфат, в качестве носителя - модифицированный солями алюминия макропористый кремнезем с диазотированными аминоарильными группами , а процесс .осуществляют при и рН 6-8. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) 14 А (51) С 07 Н 19/20; В Оl .I 20/22

// С 07 6 7/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ l

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ,2

;Я /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ, (21) 3438737/28-13 (22) 14.05.82 (46) 30. 11.83. Бюл. В 44 (72) В. П. Варламов, Г. Е. Банникова, А. А. Зейдака, В. В. Тарасевич:.. и С. В. Рогожин (71) Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова и Научно-производственное объединение "Биохимреактив"

53) 577. 15 (088. 8) (56) 1. Jervis L., Й.М. Pettit,J.

Chromatogгаphy, 1974, 97, 33-38

2. Miichek И., Gorecki И. "Methods ,in Ensymoiogy", 1974. 34, В, 492-496.

3. Авторское свидетельство СССР Р 688431, кл. С 01 В 33/12, 1977. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО СОРБЕНТА путем связывания лиганда на основе уридина с носителем, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения химической стойкости сорбента, в качестве лиганда используют 5-оксиуридин -2 (Я 5(дифосфат, в качестве носителя — модифицированный солями алюминия макропористый кремнезем с диазотированными аминоарильными группами, а процесс осуществляют при 410 С и рН 6-8.

1 10575

Изобретение относится к способам получения биоспецифических сорбентов, используемых в аффинной хроматографии ферментов, имеющих сродство к компонентам нуклеиновых кислот. 5

Известны способы получения биоспецифических сорбентов, содержащие в ка-честве иммобилиэованного лиганда нуклеозид-3,5-дифосфаты. Например, ° i 1 известен способ получения сорбента на основе гуанозин-2 (37,$ -дифосфата, согласно которому носитель — пористое. стекло подвергают взаимодействию с 3-аминопропилтриэтоксисиланом в течение 6 часов, полученное аминопро- 15 пилированное стекло обрабатывают р-нитробензоилхлоридом, восстанавливают нитрогруппу дитионитом натрия в водном растворе. Полученное аминоарильное производное стекла диазоти- 20 руют, затем добавляют 1,5-диоксипафталин из расчета 100 мг на l г сорбента в растворе ацетата натрия, нафталичсодержащее стекло отфильтровывают на фильтре. В качестве лиганда 25

I используют 5- (4-аминофенйлфосфорил)гуанозин-2 (3 7-монофосфат, который по6 лучают конденсацией гуанозин-2,3-цик( лофосфата с р-нитрофенилфосфатом с использованием в качестве конденсирую(идрированием 107 ны у ле. Полученный лиг и смешивают с нафтал стеклом в 0,5 M бика ре рН 9,0. Реакцию п чение 1 ч при 40С, б сорбент отделяют фил

Однако данный спо биоспе ического о нд диаэотируют нсодержащим бонатном буфеоводят в теоспецифический тровани ем (1) . об получения бен

»» Q о-г-о о " + Вгс»-с ирар((оГ»

2 1

ОН

О 0

Я О Р;Н, Е О |

11 ll — сещароэа- о-о-»H Q - о (О О сорбенты на основе се дают достаточной меха стью и химической сто

50 того, образующаяся в между аминами и BrCNдостаточно прочна и в нуклеофилов лабильна, ет абот розы не облаческой прочноостью. Кроме оцессе связь фарозой не рисутствии то затрудняр у с данными сорбентами.

Цель изобретения — упрощение спо55 соба и повышение химической стойкости сорбента.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения бно1

Однако известный способ имеет ряд недостатков, связанных со сложностью и трубоемкостью получения используемого лиганда, сийтез которого основан на использовании дефицитных веществ (например, фермента фосфодиэстерезы иэ змеиного. яда) и длится

Ю несколько дней, после чего непосредственно осуществляют синтез сорбента; необходимостью использования в качестве носителя BrCN"активированной сефарозы (BrCN, как известно, является высокотоксичным соединением, 14 з щего агента дициклог ксилкаободиимида. Нитрогруппу в сстанавливают до аминогруппы ка алитическим палладием .на иф с р та очень сложен и трудоемок. С1интез сорбента занимает не менее двух недель.

Используемая в способе обработка стекла 3-аминопропилтриэтоксисиланом влияет на проявление сорбентом анионообменных свойств, что снижает селективность очистки.

Наиболее близок к предлагаемому по технической сущности способ получения биоспецифическо о сорбента на основе уридина, котор 1й заключается в том, что лпганд -производное фосфорилированного уриди а связывают с носителем — ВгСЙ-акти ированной сефарозой при 4 С и рН,0 j2) .

Схема получения да ного сорбента может быть выражена с едующим обра— зом:

НО

ОН ОН

1.Br,820; ПиРИдци

2. ПгРК о

Ног -о-гг снД; осн,снсн,о-с-©-нн, 0Е О

HNQ

11

НО -P-О

ОН о о

РОънг н

О

Но „Z

l 1 ггог -о-гг-(сн,}, осн,снсн,о- с

I II Я О

0Н О н,ohio

О 0

ОЗН2 гН

Э 10575 специфического сорбента путем связывания лиганда на основе уридина с носителем в качестве лиганда использу(.

1от 5-оксиуридин-2 (3) 5-дифосфат, в качестве носителя — модифицированный солями алюминия макропористый кремi

1. у — эпоксиаропилсилан

2. НС1

° ° ° °

I згог — о-gi $ снД о-eHgeH-CHgoH

ОН г. огн О с г. (н),!

Синтез лиганда начинают с введения гидроксильной группы в пятое положение пиримидииового ядра. Для этого уридин растворяют в бромной воде и обрабатывают свежеперегнанным пиридином при нагревании до 120 С в течение 5О

5-12 ч. Затем реакционную массу упаривают и остаток кристаллизируют из этанола. Полученный 5-оксиуридин тщательно высушивают над РоО и фосфорилируют полифосфорной кислотой при

80 С в течение 4 ч. Затем избыток

О полифосфорной кислоты разлагают водой при 120 С, а продукт фосфорилирования

14 4 ,неэем с диазотированными аминоарильными группами, а процесс осуществляют при 4-10 С и рН 6-8.

Способ осуществляется по следующей схеме (показаны и стадии подготовки носителя и синтеза лиганда): выделяют анионаобменной хроматографией.

Синтез сорбента ведут исходя из кремнеземов, модифицированных солями алюминия (3, покрытых органическими полимерами с гидроксильными группами. Органические полимеры на поверхность кремнеземов вводят, обрабатывая кремнезем силаном, содержащим эпоксигруппы, которые при размыкании дают диольную группировку. Для введения аминоарильной группы гидроксилсодержащие органокремнеземы в кипящем толуоле обрабатывают в течение ния самого сорбента, так и в процессе синтеза исходных. Общая продолжительность в 4 раза меньше, чем в известном способе (учитывая стадии под- 20 готовки лиганда и носителя) .

Биоспецифический сорбент, получаемый предлагаемым способом, обладает высокой химической стойкостью, так как не содержит гидролитически ла- 25 бильных связей, как в случае биоспецифического сорбента, получаемого по способу прототипу °

Высокая химическая стойкость. возрастает также вследствие исполь- 30 эования модифицированной солями алюминия кремнеэемной основы . Стабильность кремнеземного сорбента после такой модификации возрастает в !О и более раэ.

Кроме того, получаемый сорбент характеризуется низкой неспецифической сорбцией (менее 0 мг белка на 1 r сорбента), так как в способе пр едусмотр ена обр аб отка кр емнез емной основы неионногенными органическими полимерами, а кроме того, иммобилизованный лиганд удален в два раза дальше от поверхности нерастворимого носителя, чем в способе45 прототипе.

Пример 1 . 3 r уридина растворяют в 15 мп воды, добавляют бром до слабого пожелтения раствора, при,пивают 15 мл пиридина и раствор нагревают в течение 5 ч при 120 С

Затем упаривают насухо и остаток кристаллизуют из этанола. Получают — Ф

1,3 r 5-оксиуридипа, который высушивают 6 ч над Р О в вакууме масляного насоса, а затем растворяют в 25 r полифосфорйой кислоты и перемешивают 4 ч при 80 С до образова0

1 ния прозрачной гомогенной массы, 40

5 10575

3 ч р-нитробенэоилхлоридом с добавлением триэтиламина. 11итрогруппу восстанавливают дитионитом натрия при и

60-80 С в течение 2 ч. Полученный сорбент суспендируют в 2,5 н.соляной кислоте, добавляют нитрит натрия и перемешивают 30 мин при 41 С, затем промывают буфером при рН 6-8 и активированный сорбент суспендируют в том же буфере, содержащем 5-ок сиуридин-.! 1О ! 1 )

2 13) 5-дифосфат и перемешивают при

40С в течение 4-12 ч.

Предлагаемый способ более прост и менее трудоемок, не требует ис.пользования высокодефицитных и токсич-15 ных реактивов как в процессе получе14 6

Добавляют 20 мл воды и раствор нагревают 20 мин при 120 С. Охлаждают и

0 доводят pkk до 10 с пом щью 4,5 н. гидроокиси лития. Осадок отфильтровывают, и суп ернатант, содержащий продукты фосфорилирования наносят

Э на анионообменник и разделяют обычным способом. Получают 1 r 5 †оксиуридин-2 (Зу 5-дифосфата . К 25 г

1 А Ф модифицированного солями алюминия склохрома в 350 мл толу

I y

10 мл 3 (2,3-эпоксипропо триметоксисилана, кипят шивании 8 ч, промывают ацетоном, суспендируют вора HCl в а етоне 0 1 м ла добавляют си)-пропилт при перемеолуолом и

500 мл растоль фический сорбент промыв т И NaCI водой и ацетоном и высуш вают в вакууме масляного насоса. орбент содержит около 35 ммоль лиганда на 1 r сорбента.

Пример 2. Процес ведут аналогично примеру !, но 5-оксиуридин ь

2 4у 5-дифосфат берут в количестве

0 2 r. Синтези ован " специфичеt р ныи б о ский сорбент содержит 7 да на 1 r сорбента.

Пример 3. Процесс логично примеру 1, но при лиганда к актйвированному ведут в течение 4 часов п

Пример 4. Процесс гично примеру 2, но присо лиганда к сорбенту провод рН 6. оль лиганведут анаоединение сорбенту и 10 С. ведут аналодинение т при

Ц /г и пере мешивают 2 ч при 20 С. Сорбент промы0 вают на фильтре ацетоном, высушива( ют в вакууме масляного асоса, суспендируют в 250 мл абсолютного хлороформа, содержащего 12,5 г хлорангидрида р-нитробенэойной кислоты и 9,4 мл. триэтиламина. Смесь кипятят при пере1 мешивании 3 ч, отмывают на фильтре хлороформом, ацетоном и водой и суспендируют в 300 мл 107.-ного водного пиридина, содержащего 12,5 r раствоI ренного дитионита натрия (Na S 04) гг4 и нагревают при 60-80 С в течение

2 ч. Аминоарильное производное органсилохрома промывают на фильтре водой и суспендируют в 5QO мл 2,5 н.

HCl. Смесь охлаждают до 4 С, при0 бавляют 10 г NaN02 перемешивают (30 мин, промывают 0,2 И ацетатным буфером при рН 7,6, затем суспендируют в 200 мл того же бу ера сот ! держащего 1 г 5-оксиуридин 2 (3) 5-дифосфата и перемешивают п1 и 4оС в течение 12 ч. Синтезированными,биоспециСоставитель О. Скородумова

Редактор Л. Пчелинская Техред М. Костик . Корректор И. Эрдейи

Заказ 9521/30 Тираж 387

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 10575

Использование предлагаемого cttocoба позволяет, получать биоспецифические сорбенты, т.е. сорбенты для взаимодействия с белками, имеющими сродство к компонентам нуклеиновых кислот.

Получаемые предлагаемым способом биоспецифические сорбенты характеризуются высокой химической и микробиологической устойчивостью из-за использования кремнеэемной основы; низкой 10 неспецифической:сорбцией, так как в способе предусмотрена обработка крем14 8 неземной основы неионогенными органическими полимерами; высокой селективностью взаимодействия вследствие значительной удаленности иммобилизованного лиганда от поверхности кремнезема в результате однозначности связывания лиганда с сорбентом.

В предлагаемом способе используется носитель, выпускаемый отечественной промыпшенностью, что позволяет осуществить крупномасштабное производство биоспецифического сорбента.