Способ иммобилизации микросом печени

 

) 1. СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем ковапентного связывания их с матрицей, от пинающийся тем, что, с пепью повышеиия монооксвгеназной активности в стабильности 1а 1мобипизоваввых мнкросом, в качестве матрицы используют поввэтвлен сб-1О% привитой попиакрвповой кислотыи процесс вецут в првсутстввв карбодиимида при соотвошеввв юарбоаиимид - полиэтилен с привитой полвакрвпо; вой кислотой 1:5-1:12. 2. Сгюсоб по п. 1, о т л н ча ю ш и и с я тем, что процесс ведут прв рН 7,2-7,6. S

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) зся) С 12 1(11/18; С 12.К 9/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

УЕНВ,р, л

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

° с

° Ю

Ва

М (21 ) 3382674/28-1 3 (22 ) 24.1 2.81 (46) 30.11.83. Бюп. % 44 (72 ) Т. И. Давиденко, О. В. Севастьянов, В.А.Андронати. и А. Д. Псмогайпо (71) Физик -химический институт

АН УССР (53) 577.15.07 (088.8) (56) 1. Богатский А.В. и др. Иммобипизапия микросомной фракции печени бепых крыс на сипохроме. АН; Сер. Б.

1979, .М 8, с. 656-659.

2. Патент ГДР % 113013, кп. С 07 S 77//0022, 1975.

3. Карузина М.И., Арчаков А.И.

Современные методы в биохимии. Медипина", 1977, с. 49-62. (S4)(57) 1. СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ

МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ путем ковадентного связывания их с матрицей, о т п и ч аю шийся тем, что, с пенью овышеиия монооксигеназиой активности и стабипьности )иммобипизованных микросом, в качестве матрипы исподьзуют попиетипен с 6-10% привитой нопиакриповой киспоты и продесс ведут в присутствии карбодиимида при соотноп)енин карбодиимид - попиэтипен с привитой попиакрипо; вой кислотой 1: 5-1: 12.

2. Способ по п. 1, о т п и ч а ю - шийся тем, что проаесс ведут при рН 7,2-7,6.

057536 2

10

25

40

1 1

Изобретение относится к биотехнопогии в частности к. .;способам попучения иммобипвзованных микросом печени. животных и может найти применение в медицине,, биохимии (иммобипизованные таким образом микрооомы могут спужить удобной моденью дпя изучения метабопизма лекарственных препаратов), в анапитической . промышпенности (для создания ферментных энектродов) и тонком органическом синтезе (дпя попучения органических веществ, таких как гидроксипированные стероиды, жирные киспоты, 1,4-бенэдиаэепик-2-оны ) .

В этих, цепях цепесообразно испопьэовать не топько отдельные ферменты, но и фракцию микросом печени животных, так как это дает возможность устранить сложные дорогостоящие процессы выдепения и очистки исходных ферментов и проводить спожные ферментативные реакции одностадийно.

Известен способ иммоби изации микросом печени на неорганической матрице (сипохроме ) с помощью бифункционапьного сшивающего реагента (хпористого цианура и 2,4-топуипендиизоцнаната) jl) .

Однако попучаемый этим способом про» дукт обпадает пишь эстеразной активностью и не проявпязт монооксигенаэной активности.

Наибопее бпизок к предлагаемому способ иммобипизации микросом печени, заключающийся в ковапеитном связывании их с матрицей (Br CN > активированной сефарозой. При этом процесс ведут при рН 7,4-7,7, а при иммобипиэации монооксигеназная система раэдепяется на компоненты: цитохром P-450, НАДФНзависимую редуктазу и фосфатидипхопин, а затем компоненты в нюбой поспедоватепьности ипи одновременно фиксируют на матрице (при этом один ипи два комионента могут оставаться в растворе в растворимом состоянии) f2) .

Необходимость раэдепения монооксигенаэной системы микросом печени на к компоненты (цитохром P-450, НАДФНзависимую редуктазу и фосфатидипхопин) церед иммобиниэацией для попучения стабипьного продукта, обпадающего актив— ностью, так как при иммобипизации самой системы микросом набпюдается попное отсутствие монооксигеназной активности, значитепьно успожняет процесс, требуя обработки упьтразвуком, хопатом и дезоксихонатом натрия и применения метода копоночной хроматографии. Монооксигенаэная активность иммобилиэованных укаэанным способом реконструированных систем ниэкаг при иммобипизации цитохрома P-450 (растворимая НАДФНзависимая редуктаэа и фосфатидипхопин) она составпяет всего 30% от исходной, а при иммобипизации НАДФН вЂ” зависимой редуктазы (растворимые цитохром P-450 и фосфатидипхопин) сохраняется 26-40% монооксигеназной активности (опреаепена по реакции H --деметипирования). Стабипьность попученной таким образом монооксигенаэной системы невысока, так как через 72 ч остается всего 7% исходной активности. Таким образом, известный способ не обеспечивает достаточно высокой монооксигенаэной активности и стабипьности иммобипизованных микросом.

Цель изобретения — повышение монооксигеназной активности и стабипьности иммобипизованных микросом.

Указанная цепь достигается cor пасно способу иммобипизации микросом печени путем ковапентного связывания их с с матрицей, в качестве матрицы испопьзуют попиэтилен с 6-10% привитой попиакриповой киспоты и процесс ведут в присутствии карбодиимида при соотношении карбодиимид - попиэтипен с привитой полиакриповой киспотой 1: 5-1: 12.

Процесс осуществпяют при рН 7,2-7,6.

Предпагаемый способ поэвопяет попучать нерастворимые микросомы, отпичающиеся высокой монооксигенаэной активностью и стабипьностью.

Функционапьные группы пегко модифи цируются иэ-за рыхлой упаковки привито го функционального покрова(попиакриловой киспоты ), функционапьные группы которого доступны дпя взаимодействия с сшивающими реагентами по всей гпубине привитого слоя, а специфический эффект повышения монооксигенаэной активности иммобипизованных микросом, вероятно, связан с созданием особых мягких условий иммобилизации в тонком при поверхностном спое, доступном для субстрата, привитой попиакриповой кислотой, т.е. данные полимерные носитепи сочетают в себе преимушества линейных гомопонимеров и трехмерных попипигандов.

Применение попиэтиленов с копичеством попиакриповой киспоты меныцим 6% нецепесообразно, таккак резко (ao 50% от от максимальной) уменьшается монооксигенаэная активность иммобипиэованных микросом. Увеличение копичества при витой попиакриповой киспоты бопее 10% не поэвопяет создать однородного (по копичеству фуикционапьных групп) носи1057536

10 теля. Поэтому используют полиэтилен с

6-10% привитой полиакриловой кислоты.

В процессе используют 0,1 М К -фон" фатный буфер с 0,1М К<А; 1 мМ

ЭДТА и 1 мМ дитиотреитола на 20%ном глицерине по объему в интервале рН 7,2-7,6, так как при значениям рН (табл. 1 ) сохранение монооксигеназной активности иммобилизова нных микросом максимально.

Весовое соотношение растворимый карбодиимид — полиэтилен с привитой: полиакриловой кислотой можно вариировать от .1:5 цо 1:12, дальнейшее его

У изменение уменьшает монооксигенаэн ю 15 активность иммобилизованных микросом (табл. 2).

Иммобилизапия проводится при 5еС в течение 24 ч. Полученные препараты иммобилизованных микросом облацают 20 значительной активностью по анилину, диметиланилину, амидопирину и этилморфину, так как сохранение активности по анилину составило 25% (этот виц и все последунллие в прототипе полностью 25 отсутствовали), а при определении активности иммобилиэованных микросом печени по диметиланилину, амидопирину и этилморфину наблюдалось значительное увеличение активности (по сравнению с исход- 30 ной): 116; 197; 8; 160% соответственно, Иммобилнзованные предлагаемым способом микросомы печени оказались ста бильными при хранении при 5 С в течение

4 недель.

Микросомы выделяют иэ печени белых крыс и кроликов согласно известной ме- . тодике (3), активность по анилину, циметиланилину, амидопирину, этищюорфину также определяли по (3) Быхоц микросо- 40 мального белка 21,7 мг г печени; содержание цитохрома P-450 2,75 нмоль/мг белка, активность по анилину 3,9 нмоль субстрата/нмоль иитохрома P-450 в мин при 37 С, активность по циметиланилину 4 а

49,7 нмоль субстрата-нмоль цитохрома

Р 450 в мин при 370С, активность по амидопирину 1 3,9 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С, акО тивность по этилморфину 5,5 нмоль субстрата-нмоль литохрома P-450 при 37 С в мин.

Пример 1. 10 г полиэтилена с привитой полиакриловой кислотой (6-10%) суспендируют в 50 мл 0,1М К-фосфатного буфера (с 0,1М КЯ; 1 мМ ЗДТА и .

1 мМ дитиотреитола на 20% глицерине по объему, рН 7,2) растворимого карбоци имица (1,0 г), затем цобавляют суспенэию микросом (1 r белка), доводят объем до 100 мл вышеуказанным буфером и встряхивают реакционную смесь 24 ч при 5 С.

Препарат отфильтровывают, затем промывают следуюшими буферными раствора1. 2 л 0,1М К-фосфатного буфера с

0,5 М КС1, "1 мМ ЭДТА и 1 мМ цитиотреитола на 20% глицерине по объему, рН 7,2.

2. 2 л 0,1 М К-фосфатного буфера с 1 мМ дитиотреитола as 20% гдицерине и хранят при 5оС

Активность по анилину 0,967 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности 25%). о

Активность по циметиланилину57,4 нмоль субстрата/нмоль цитохрома

P-450 в мин при 37ОС (сохранение активности 116%). Активность по амицо p пирину 27,6 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 370С (сохранение активности 197,8%). Активность по этилморфину 8,8 нмоль субстрата/нмоль питохрома P-450 в мин прн 37 С (сохранение активности 160%).

После 4 недель хранения при 5 С иммобилизова нных микросом активность по анилину составляет 100%, а по диметиланилину 74% (от опрецеленной сразу после иммобилизации) .

Таким же образом проводят иммобилизацию фракции микросом на полиэтилене с привитой полиакриловой кислотой (6-10%) с тем же буфером, только при рН 7,4 и 7,6.

Получают аналогичные результаты.

Пример 2. 10 r полиэтилена с привитой полиакриловой кислотой (6-10%) суспенцируют в 50 мл 0,1 М К-фосфаты ного буфера (0,1М КС1, 1 мМ ЭДТА и

1 мМ цитиотреитола на 20% глицерине по объему, рН 7,2) растворимого карбодиимида (0,8 r), затем добавляют суспенэию микросом (1 г белка). После этого. все операции выполняют аналогично примеру 1. . Активность по анилину 0,92 нмоль субстрата/нмоль цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности 24%).

Активность по циметиланилину 54,5 нмоль субстрата/нмопь цитохрома Р 50 в мин при 37 С (сохранение активности 110%).

Активность цо амидопирину 26,2 нмоль субстрата/нмодь цитохрома P-450 в мин при 37 С (сохранение активности 190%)

Активность по этилморфину 8,4 нмоль

105753G

Таблица 1

Сохранение монооксигенаэной активности иммобилизованных при различных значениях рН микросом на полиэтилене с привитой полиакриловой кислотой (субстрат диметиланилин).

М онооксигеназная активность микросом иммобилизова нных, % от исходной, при рН

70 81

104 116 . 116

1 16 104 81

Таблица 2

Сохранение монооксигеназной активности иммобилиэованных при различном соотношении карбодиимид - полиатилен с привитой полиакриловой кислотой микросом печени (субстрат - циметиланилин) Монооксигеназная активность нммобнлизованных микросом, % от исходной, при соотношение карбодиимид - полиэтилен с привитой полиакриловой кислотой

1:20

66 83,5 116

110.46

Составитель О. Скородумова

Редактор Л. Пчелннская Техред М.Надь Корректор М лароши

Заказ 9469/31 Тираж 523

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 субстрана/нмоль цитохрома Р-450 в мин при 37 С (сохранение активности 152%).

После 4 недель хранения при 5ОС нммобилиэованных микросом активность по анилину составляет 100%, а по ди- 5 метиланилину 75% (от определенной сразу после иммобилизации).

Таким же образом проводят иммобилиэацию фракции микросом на полиэтилене с привитой полиакриловой кислотой (6-!

10%) с аналогичными соотношениями всех компонентов, только с 1,2 r растворимого карбодиимица.

Полу иют аналогичные результаты.

Аналогично примеру 1 при укаэанных в примере 2 количествах растворимого карбодиимида проводят аммобилиэацию фракции микросом при рН 7,4 и 7,6. Получают результаты, аналогичные приведенным в примере 2. !