Штамм @ @ @ -38 продуцент экзо- @ - @ - ацетилглюкозаминидазы

 

Штамм Bacillus subtilis G-38 (коллекция Центрального Музея промышленных .микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный но ,мер ИМПМ В-2471) - продуцент экзо-|Ь-Ы-ацетилглюкозаминидазы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУЕ ЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К:ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР, ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЖ (21) 3446658/28-13 (22) 31.05.82 (46) 15.12-83, Бюл. Р 46 (72) В.Д. Паюодис, B.Þ. Авиженис, Т.Ю. Падегимас, П.Д. Валанчюс, И.Л. Мармене и Ю.Ф. Василяускас (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энэимологии (53) 577.15 (088.8) . (56) 1. Ortiz I.Т. Ana.Ies de Ia йеа1 Akademia de Еаrmacia, 1975, 41,1,53-157.

2. Авторское свидетельство СССР

9 587155, кл. С 12 N 1/20, 1976 (прототип) °

„.SU„„1060678 А

3$9 С 12 N 15 00 С 12 N 9 36 (54) ШТАММ BACILLUS SUBTILIS С-38

ПРОДУЦЕНТ ЭКЗО-p-N-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИНИДАЗЫ. . (57) Штамм BaciIIus subtiIis f.-38 (коллекция Центрального Музея промышленных .микроорганизмов института . "ВНИИгенетика", коллекционный но,мер ЦМПМ В-2471) — продуцент экзо-p-N-ацетилглюкоэаминидазы.

1060678

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для биосинтеза фермента экзо-р-N-ацетилглюкозаминидазы.

Известны штаммы-продуценты экзо5

-p-N-ацетилглюкозаминидазы, как

BaciIIus subtiIis Р., BaciIIus cereus, BaciIIus megatherium, BaciIIus

IichemiformiS

Недостатком этих продуцентов является сравнительно низкий уровень экзо-.p -N-ацетилглюкозамидазной активности

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является штамм BaciIIus subtiIis G-19, который при глубинном культивировании обладает экзо-p-N-ацетилглюкозаминидазной активностью по колори- 20 метрическому методу и составляет

13 мед/мл (2 ).

Недостатком штамма является то, что он характеризуется низкой ферментативной активностью при глубин- 25 ном способе культивирования, сама культура мало стабильная, культура не используется при производстве ферментного препарата экзо- -N- p

-ацетилглюкозаминидазы. Ытамм ЗО

Bac i I Ius subti I is G-19 известен как продуцент эндо- и экзо-ацетилглюкозаминидазы.

Цель изобретения — получение нового высокоочищенного штамма — про35 дуцента, сохраняющегс стабильность биосинтеза во время глубинного культивирования.

Для получения такого штамма

Iïðoäóöåíòà экзо-р-N-ацетилглюкоэ аминидазы были выделены из природы различные микроорганизмы, способные к биосинтезу данного фермента.

Из выделенных штаммов отобран высокоактивный штамм по биосинтезу экзо-р-K-ацетилглюкозаминидазы и идентиФицирован как Bac2.IIus

subtз.Iis G-38.

Полученный новый штамм ВасiIIus

subtiIis G-38 продуцент экзо-p-N-ацетилглюкозаминидазы хранится в 50

Центральном музее промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под коллекционным номером:

ЦМПМ В-2471.

Культура Baci1Ius subtiIis Г-38 55 обладает следующими морфологическими и культурально-физиологическими свойствами. Величина клеток односуточной культуры на мясопептонном бульоне 1,6-2,7 мк на 0,3-0,5 мк. 6р

Клетки отличаются большой вариабильностью в отношении размеров. Выращенные на среде с глюкозой или на картофельной среде в мазках под микроскопом они представляются в виде толстых больших палочек, обычно расположенных в цепочки. Палочки окрашиваются равномерно, подвижные с помощью перетриховых жгутиков, грамположительны, образуют споры без капсул. Споры обычно эксцентральные, реже расположены в центре.

Они цилиндрические или эллипсоидальные, размеры 1,1-1,3 мк на

0,5-0,7 мк. Споры обычно прорастают экваториально путем разрыва мембраны вдоль экватора.

На мясопептонном агаре после односуточной инкубации в термостате при 37 С образуются колонии дйа-. метром 2-7 мм. Они сероватые, непрозрачные, складчатые, в центральной части поверхности колонии верХушка беловато-серого цвета.

На ломтиках картофеля рост культуры довольно обильный, пленка сухая, толстая, морщинистая с продолговатыми складками, серовато-белого цвета.

На мясопептонном бульоне рост особенно характерный,, поверхность бульона покрывается толстой морщинистой желтовато-серой пленкой, а сам бульон остается прозрачным.

Культура BaciIIus subtiIis G-38 является строго аэробного типа с оптимальной температурой роста

37 С при рН 6,4-6,6. Продуцент

BaciIus subtiIis G-38 для роста усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу и глюкозамин с образованием кислоты без выделения газа, разжижает желатину, гидролизует крахмал. Нитраты восстанавливает до нитритов. На среде Кларка образует ацетилметилкарбонол.

Пример 1. Для выращивания штамма BaciIIus subtiIis G-38 служит питательная среда следующего состава, г/л воды:

Крахмал 45,0 .Калий сернокислый 3,3

Магний сернокислый 0,17

Натрий хлористый 0,3

Кукузурный экстракт 26,0

Аммоний фосфорнокислый 5,0

Марганец сернокислый 1,0

Кальций углекислый . 0,13

Питательную среду указанного состава по 100 мл разливают в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при 121 С 30 мин. Стерильную питательную среду с рН 6,5 засевают культурой BaciIIus subtiIis G-38, выращенной на ломтиках картофеля.

Культивирование продуцента проводят на качалках (150-180 качаний/мин при 37oC). На 8-12 ч роста экзо- р

-N-ацетилглюкозаминидазная актив-, ность в культуральной жидкости в среднем составляет 16 мед/мл. Активность экзо-p-N-ацетилглюкозаминидазы

1060678

Составитель И. Привалова

Техред О.Неце Корректор О. Тигор

Редактор Н. Киштулинец

Заказ 9971/28 Тираж 523, Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская =наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4 определяют колометрически по интенсивности окраски образовавшегося и-нитрофенила при экзиматическом расщеплении синтетического субстрата г;нитро-фенил-p-N-ацетилглюкозаминида.

Пример 2. Культивирование штамма ВасiIIus subtiIis G-38 в бродильнйх установках типа "Виолофит" .

Для культивирования данного продуцЕнта в бродильных установках типа "Биолофит" емкостью 20 л с объемом 10 л служит питательная среда, состава аналогичного примеру 1.

Компоненты питательной среды в

"Биолофите" стерилизуют при 120 С.

Стерильную питательную среду (рН 6,5) охлаждают до 37-40 С и засевают споровой культурой Вас i1Ius

subtiIis G-38, Культивирование проводят при 37 С, аэрация 5 л, размешивании 300 об/мин. Максимальную активность в культуральной жидкости определяют на 7-12 ч роста штамма

BaciIIus subtiIis G-38. Оптимальная активность в культуральной жидкости составляет 22 мед/мл.

При использовании нового штамма t0 BaciIIus subtiIis G-38 продуцента экзо-р-N-ацетилглюкозаминидазы создается возможность увеличить активность данного фермента на 69%.

35 Экономическая эффективность при широком производственном применении этого штамма составляет

20 тыс.руб. в год.