Штамм гриба @ @ @ -130-продуцент лимонной кислоты

 

ССЮЭ GOBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

tl т.(21) 3465878/28-13 (22) 10.05.82 (46) 30.12.83. Бюл. Р 48 (72) Е.Я. Щербакова, В.М. Голубцова, Ю.д. Бережной, A.Ê. Садиков, . О.М. Кандель, В.А. Потехина, Л.И. Старцева и В.Н. Жданова (71) Ленинградский межотраслевой . научно-исследовательский институт пищевой промышленности (53) 661 ° 734.1(088.8) (56) 1. Патент США 9 3801455, кл. 195-28, опублик. 1974.

2. Авторское свидетельство СССР

М 778260, кл. С 12 К 1/02,. 1979...SU„„10 А

3(50 С 12 N 15 00 С 12 Р 7 48 (54) UITAMN ГРИБА ASPERGILLUS NIGER

Л-130 - ПРОДУЦЕНТ ЛИМОННО КИСЛОТЫ. (57) Штамм гриба Aspergillus niger

Л-130 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", регистрационный номер ЦНПМ F-204) - продуцент лимонной кислоты.

1063832

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма, используемого для .производства лимонной кислоты при поверхностном выращивании его на углеводсодержащих средах.

Известны различные штаммы-продуценты лимонной кислоты рода Candi—

da Pichia, Debaryomyces, Brettanomy-.

ces, Brevibacterium, Согупebacterium, Arthrobacter, Achromobscter, Pcnicil- 20

lium, полученные с помощью радиации высокой энергии: УФ-, Со о, Х-лучи и др. или путем воздействия химических мутагенов: нитрита натрия, гидроксиламина, нитрозогуакидина, 25 акрифлавина 8-азогуанина и азотистого пирита (1) .

Известен штамм гриба A,niger Л-106> имеющий высокую продуктивность по образованию лимонной кислоты, но отличающийся замедленным ростом на средах из мелассы н течение 12 ч после посева конидий (2) .

Цель изобретения - получение продуцента лимонной кислоты для понерхностного способа культивирования, быстро Растущего на средах из мелассы, обладающего высокой продуктивностью на мелассах различной ферментации и, одновременно, отличающегося стабильностью культур при размножении.

Штамм получен в результате многоступенчатой,селекции музейного штамма Р 130, сохраняемого н коллекции чистых культур микрорганиэмов JIHIIHIIII, 35

Первая ступень селекции состояла в искусственном отборе естественно" нозникаюших активных форм (спонтанный QT6op), в результате получен вариант Р 15, синтезирующий на 13% 40 больше лимонной кислоты по сравнению с исходным штаммом. Дальнейшая селекция варианта 130/15 с помощью комбинированной обработки парами этиленимина в течекие 1 ч и УФ-лучей в

45 дозе 1 кДж/м позволила получить вариант 130/15-62, превосходящий кислотообразонание исходного штамма

130 на 21,5В.

Последующий спонтанный отбор дал возможность увеличить активность исходного штамма до 30%. В результате получен вариант 130/15-62/2, который подвергли дальнейшей селекции с помощью комбинированного воздействия парами диэтилсульфа а (ДЭС ) в течение 3 ч и УФ-лучами -в дозе 1 кДж/м2 ° Выделенный после мутагенной обработки с последующим спонтанным отбором вариант 130/15-62/2-3/5 синтезировал 2100 r лимонной кислоты с 1 м н сутки. Конидии этого актинного нарианта обрабатывали парами этиленимина н течение

15 мин в сочетании с УФ-облучением н дозе 1 кДж/м . В результате полу- 65 чен вариант 130/ 15-62/2-5-73, названный впоследствии Л-130. Образующий до 2120 г кислоты с 1 м в сутки, что превысило кислотообраэование у исходного родительского штамма

130 на 42,3% (табл. 1).

Селекционированный штамм генетически существенно отличается от серии производственных штаммов, применяемых в СССР.

Штамм Л-130 имеет следующие отличительные морфологические признаки: стеригмы первого порядка у него длиннее в 2,5 раза, поверхность оболочки конидий покрыта шипами, у производственных штаммов ЭУ-119, P-1, Л-106 оболочка кокидий бугорчатая, Штамм Л-130 образует конидии зеленс вато-черной окраски на длинных конидиеносцах.

Конидии у нового штамма начинают прорастать через 5,5 ч, у производственных штаммон Р-1 и Л-106 через 9 ч.

Изучение устойчивости штамма

Л-130 к бактериям, сопутствующим производству лимонной кислоты, показало, что новый штамм не уступает производственным штаммам по устойчивости к Б. acrogenes, Е. coli u более устойчив к Вн.о. mesentericus.

Исследование продуктивности штамма Л-130 на образцах мелассы среднеи ферментируемости показало, что на этой мелассе штамм Л-130 сохраняет активность на высоком уровне (1800-2100 r с 1 м в сутки), выход от сахара 74-82%; в то время как производственный штамм Л-106 на данной мелассе синтезирует 1600-1750 r, выход лимонной кислоты от сахара состанляет 61-67%. Такие мелассы в настоящее время имеют все большее распространение и применение их на заводах лимонной кислоты приводит к значительному снижению съемов кислоты с единицы оборудования и снижению выхода ее от сахара.

Таким образом, штамм Л-130 гарантирует более высокую устойчивость и более высокую продуктивность биосинтеза лимонной кислоты при культивировании на мелассах, применяемых н производстве по сравнению со штаммами Aspergillus niger, исполь- зуемыми в настоящее время в производстве при поверхностном выращивании.

Морфолого-физиологическая характеристика штамма.

Морфологические свойства штамма изучали у пятисуточных культур, выращенных при 32 С.

Новый штамм Aspergiglus niger

Л-230 на сусло-агаре образует круглую колонию диаметром 41-43 ьж. Субстратный мицелий кремовый, плотный радиально-складчатый. Складчатость более выражена н центре колонии в

1063832,4 диаметре 15 мм. Воздушный мицелий (создаВаемый конидиеносцами) белый, средней опущенности. Конидиальные головки зеленовато-черноокрашенные, крупные, обильно образуются по всей поверхности колонии. Нарастающий край колонии, лишенный зрелых конидиальных головок, шириной около 1 мм.

На среде Чапека колонии диаметром

48-50 мм. Диаметр конидиальной го- 1О ловки 100-128 мкм. Максимальная длина конидиеносца 4 мм, диаметр сечения пузырька конидиеносца 53-58 мкм.

Стеригмы двуслойные. Первичные стериг мы длиной 24-28 мкм, вторичные 15

8-10 мкм. На каждой первичной стеригме образуются по две вторичные стеригмы. Конидии шарообразные с темноокрашенной шиповидной оболочкой диаметром 3,0-3,1 мкм. 20

Таким образом, основными отличительными морфологическими особенностями нового штамма являются следущие.. Стеригмы первого порядка у него в 2,5 .раза длиннее, поверхность оболочки конидий покрыта шипами, у производственных штаммов,в том . сле и у штамма Л-106 оболочка конидий,бугорчатая ° Штамм Л-130 образует конидни на длинных конидиеносцах, конидии обладают более высокой энергией прорастания.

Ъ

Штамм Л-130 подавляет развитие бактериальной флоры, сопутствующей. производству лимонной Кислоты: В.acrogenes, Е. coli, Вас. mesertericus, не уступает производственным штамма по устойчивости к этой микрофлоре и более устойчив к Вас. mesentericus.

Способность к образованию лимонной кислоты у штамма Л-.130 изучали при культивировании его на поверхнос-. ти мелассных сред в лабораторных

Условиях. Среды для ферментации при- 45 готавливали из мелассы различной ферментируемости Гиндештского и Новопокровского и других сахарных заводов, качественно различающейся между собой. Режим культивирования обеспечивал максимальный выход лимонной кислоты от сахара и одновременно наибольший съем лимонной кислоты с единицы площади в сутки.

Пример 1. Испытания прово.дили в лабораторных условиях. Посевной

: материал (конидии грибов ) выращивали на пивном неохмеленном сусле, разбавленном до 7% по сахару. В разбавленное сусло добавляли 2% хлорис-: того натрия, (,1% мочевины, 0,0001% 60 сульфата меди, 2% агара. Конидии грибов, выращенные на этой среде и сме шанные с тальком в соотношении 1:2, применяли для посева их мелассные среды. 65

Состав мелассной среды, г/л:

Свекловичная меласса (48%-ная по сахару) Гиндештского завода заготовки 1979 г 320

Карбонат натрия безводный 0,4

Гексацианоферроат калия, гидрат 2,1

Дигидроортофо сфат калия 0,1

Сульфат цинка, гидрат 0,005 рн 7,0-7,1

Испытания проводили в химических стаканах с площадью дна 0,41 дм

Объем ферментируемой мелассной среды 500 мл (высота слоя 12 см).

На поверхность среды высевали конидии штамма Л-130. Продолжительность ферментации 7 сут., температура .воздуха в термостатной комнате 32оС.

В тех же условиях выращивали производственный штамм Л-106.

По окончании опыта у штамма Л-130 получено 60,8 г кислоты в среднем на

1 стакан, съем лимонной кислоты в пересчете на 1 м в сутки составил

2120 г, выход лимонной кислоты от сахара мелассы 81,7%. У производственного штамма Л-106 получено

53,1 r кислоты, в среднем с 1 м в сутки 1850 г, выход кислоты от сахара 70,7% (табл. 2) .

Особенность применяемой мелассы для культивирования штаммов состоит в том, что для ее обработки требуется высокая доза гексацианоферроата калия-2,1 г/л среды вместо 1,21,5. г/л для других образцов меласс.

Штамм Л-130 образует практически одну лимонную кислоту, в то время как у сравниваемого производственного штамма Л-106 накапливается до

3% побочной глюконовой кислоты (табл. 3). Среднесуточный съем лимонной кислоты на мелассе Гиндештского завода у штамма Л-130 возрастает по сравнению со штаммом Л-106 на

14,6%, выход лимонной кислоты от сахара увеличивается на 10%.

Пример 2. Испытания проводили в лабораторных условиях. Конидии грибов выращивали на пивном неохмеленном сусле по способу, описанному в примере 1. Собранные конидии применяли для засева бродильной мелассной среды.

Состав мелассной среды, г/л:

Смесь меласс

Новопокровского, Хохольского и Жердевского сахарных заводов эаготонки 1950 r 300

Гексацианоферроат калия, 1063832

1,8

0,14

0,15 10

Таблица1

Сравнение кислотообразующей способности исходного штамм 130 и мутантов, полученных путем селекции

1! Выход ли монной кислоты от сахара, %

Образование лимонной кислоты

Продуктивность единицы массы мицелия, r

Ступени селекции

Штаммы г/(м ° сут. )% к исход l ному штамму

57 + 2

65+ 3

69+ 2

74,2 + 0,8

100

1490 + 50

1690 + 80

1810 + 50

1940 + 20

1980 + 20

130 исходный

130/15

130/15-62

130/15-62/2

113,4 .

121,5

130,2

132,9

140,9

142,3

5,41

6,30

7,2

130/15-62/2-3

75,8 + 0,8

7,3

7., 35

80 + 1.

81+ 1

130 15-62/2-3/5 2100 + 30

130/15-62/2-3/5-73 2120+ 40 (Л-130) 7,4

VI гидрат

Трилон "Б" (соль динатриевая этилендиамин

N(N(И N

-тетрауксусной кислоты),бигидрат 0,05

Дигидроортофосфат калия

Сульфат цинка, гидрат 0i01 рн 6,85

Режим культивирования такой же, как в примере 1. У штамма Л-130 по- 15 лучено на стакан в среднем 52,5 0,2 r лимонной кислоты, съем лимонной кислоты в пересчете на 1 м 1830+80 r, выход лимонной кислоты от сахара 70%. У производственного штамма 20

Р-3 получено 46,8+0,1 r лимонной кислоты,с 1 м в сутки 1630+50 г, выход лимонной кислоты от сахара 62,4Ъ.

Пример 3, Испытания проводили25 в ЦЗЛ Выборгского завода лимонной кислоты, Посевной материал штаммов

Р-1.и Р-3 поставлялся Рижским экспериментальным заводом биохимических препаратов, штамм Л-106 Ленинградским комбинатом по производству лимонной кислоты. Конидии штамма

Л-130 выращивали в ЛНИИПП на пивном неохмеленном сусле по способу, описанному в примере 1.

Состав мелассной среды, г/л: 35

Смесь меласс

Новопокровского, Хохольского и Жердевского сахарных заводов заготовки

1980 r 300

Карбонат натрия 0,05

Гексацианоферроат калия, гидрат

Дигидроортофосфат калия 0,15

Сульфат цинка, гидрат 0,01 рН 7,0

Культивирование проводили в химических стаканах с площадью дна

0,47 дм . Высота слоя ферментируемой мелассной среды 12 см. Режим культивирования такой же, как в примерах 1 и 2.

Результаты опыта отображены в табл, 4, Как показывает таблица, новый штамм Л-130 является более продуктивным, чем другие производственные штаммы и образует на 12,5% боль;ше лимонной кислоты.

Таким образом, на основе нового штамма Л-130 производится посевной материал высокого и стабильного качества для ферментации меласс различного состава. При культивировании на этих мелассах новый штамм обеспечивает одновременно высокий съем лимонной кислоты с единицы площади в сутки и высокий ее выход от сахара, 7

1063832

Таблица 2

Сравнение активности Aspergig2us niger штамма

Л-130 и производственного штамма Л-106 на мелассных средах, приготовленных из мелассы

Гиндештского сахарного завода

Образование лимонной кислоты

Выход лимонной кислоты от сахара,% г/(м . сут), % к прототипу

Л-106

1850 + 10

2120 + 40

70,7. + 0,4

81+ 1 (прототип .

100

114,6

Л-130

Таблица 3

Соотношение кислот в сумме образуемых органических кислот при ферментации мелассных сред штаммами Л-130 и Л-106

Соотношение кислот,%

Штаммы

Лимонная Глюконовая

Л-106

2,66

97,34

99,44

Л-130

0,56

Таблиц а 4

Сравнительные данные по испытанию кислотообразования у производственных штаммов Л-106, P-1 и P-3 и селекционированного штамма Л-130 в ЦЗЛ Выборгского завода

% отно- 1 Выход сительно лимонной штамма . кислоты

Л-106 от сахара, Количество образовавшейся лимонной кислоты на стакан, г

Штаммом

Составитель М. Ларина

Редактор Е. Лушникова Техред A,Бабинец Корректор А.ПовхЗаказ 10472/27 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. ужгород, ул. Проектная, 4

P-1

Л" 106

P-3

Л-130

50,5+0,4

51,6+0,9

53к7+Ос9

58,14.0,3

Образование лимонной кислоты в граммах с 1 м в сут, 1593

1618

1684

1821

98,4, 100

104

11 2,.5

67,3

68,8

71,6

77,5