Способ получения рестриктазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ , включающий культипирование клеток штамма ..ооб1 -продуцента рестриктазы, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков , получение экстракта и последующую хроматографию, отличающийся тем, что, с целью расширения ассортимента эффективных рестриктаз и сокращения времени их получения, в качестве штамма i cjoti используют штамм fc.uoLlCK, продуцирующий рестриктазу . сй UL с сайтом, имеющим следующую Н}та1еотидную последовательность; |ЫТ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ОЗИМ ОО

РЕСПУБЛИК (19) (111

7041 А

3(511 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К АВ ИМ СИОМФ ОВИДЕ7ЕЛЬСТВУ

О\

МИ

° °

ММ

ГОСУДАРСТВЕННЬ(Й КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3400900/ЗО- 15 (22) 15 6382 (4б) 1ИП.84. Бюл. У 2 (72) С. С. Дебов, Т. И. Тихоненко, И. И. Никольская-..Сакович, Т. М. Упорова, E. Н. Рубцо-: на, Б. С. Иародицкий, 10. R. Худяков и

И, M. rpy6ep (71) Лаборатория энзимологии AMH СССР, Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского и Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечни кона. (53) 575.ИЗ (088.8) (5б) 3. Takahashi М. et al. Gene, 1979, 5,9-18.

2; Nlkafskaya 1.1. et а1. Mol. and СеИ Bioche(n, 1976, 13, 79 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТА—

ЗЫ, включающий культивирование клеток штамма P.ash„-продуцента рестриктазы, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков, получение экстракта и последующую хроматографию, отличающийся тем, что, с целью расширения ассортимента эффективных рестриктаз и сокращения времени их получения, в качестве штамма Q используют штамм Е Са tл,(<, продуцирующий рестриктазу Е. с (Ê с сайтом, имеющим следующую нуклеотидную последовательность: 3 М ®3, причем хроматографию осуществляют с использованием голубой сефарозы и феннлсефарозы, а злюат собирают в глицерин.

1067041

Ф

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения новой сайт-специфической эндонуклеаэы (рестриктазы) .

Способы получения рестриктаэ традиционны.

Получение рестриктазы ВЬД состоит из нескольких этапов: накопление биомассы, разрушение клеток, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот обработкой сульфатом стрептомицина, высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрация на био- 10 геле А-05М, анионообменная хроматография на

ДЕАЕ-целлюлозе, катионообменная хроматография на фосфоцеллюлозе P-11, диалиэ против

50% глицерина (1).

Недостатки известного способа состоят в том, что ионообменники обладают незначительной емкостью и невысокой разрешающей способностью. Полученные препараты ферментов разбавлены (не концентрированы) и требуют специальной процедуры ко щентрирования. Регенерация ионообменников является тру доемкой проь, дурой и занимает много времени (5 — 10 дней).

Наиболее близким к изобретению является способ получения рестриктазы иэ штамма 25 а.жс ск р).

Однако данный способ также имеет указанные недостатки.

Бель изобретения — расширение ассортимента эффективных рестриктаз и сокращение времени30 их получения.

Для достижения указанной цели в качестве штамма R.Со@. используют штамм ЯЛоЬСК йродуцируннций рестриктазу <.со GC c сайтом, имеющим следующую нуклеотидную носледова 35 тель ность:

Фхт T ),сне(и)ди>р, причем хроматографию осуществляют с испольхованием голубой сефарозы и фенилсефарозы, а элюат собирают в глицерин.

Пример. 1. Способ получения фермента содержит следующие стадии: получение бактериальной массы, разрушение клеток, нолучение голубого экстракта, хроматографию на го«..

"лубой сефарозе, хроматографию на фенилсефароэе. Элюирующая система представлена градиентом концентрации NaCI от 10 до 0,5 М и глицерина от 0 до 50 o. Фермент во фракциях не обнаружен.

Пример 2, Способ получения фермеп--э0 та включает получение бактериальной массы, разрушение клеток, получение грубого экстрак. та, хроматографию на голубой сефароэе, хроматографию на фенилсефарозе. Элюирующая система представлена градиентом концентрации

MaCI от 1 0 до 0,0 М и глицерина от 0,0 до

50%; фермент элюируется четким пиком в трех фракциях.

Пример 3 Способ получения фермен та включает получение бактериальной массы, разрушение клеток, получение грубого экстракта, хроматографию на голубой сефарозе, хроматографию на фенилсефарозе. Элюируюшая система представлена градиентом концентрации

NaCI от 1,0 до 0,0 М и глицерина от 25 до

50% . Фермент элюируется нечетким размытым пиком в.9 фракциях. для стандартной процедуры выделения фермента выбран пример 2. Фермент обнаруживается в последних.фракциях градиента, соответствующих 0,0 — 0,05 М NaCI и 49 — 50% глицерина.

Предлагаемый способ отличается следующей " особенностью: элюирование фермента осуществляется непосредственно 50%-ным глицерином, что позволяет исключить стадию стабилизирующего диализа; ферментный препарат хранится о при -20 С в течение 18 мес без потери активности. Активность фермента определена в инкубационной смеси, содержащей 1 мкг ДНК бактериофага лямбда 6 мМ трис-HCI буфера рН 7,5, 6 мМ МпС4 и 6 MM -меркаптоэтанола. После 60 мнн инкубации при 37 С фрагментацию ДНК тестируют электрофореэом в пластинчатом 0,8%-ном агарозном геле.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. Удельная активность полученного препарата 700 ед/мл и 6.800 ед. активности из 10 г сухой биомассы.

Пригодность полученного фермента для структурных исследований ДНК и опытов по конструированию in vitro рекомбинантных молекул ДНК определяют следующим образом: чтобы оценить полноту очистки рестриктазы от неспецифических эндонуклеаз ДНК лазмиды pBR 322, не содержащие сайта расщепления эндонуклеаэы с..саЬ 0К инкубируют с 10-кратным избытком фермента в течение 6 ч и далее анализируют электрофоретическое поведение плазмидной ДНК; отсутствие экэонуклеаз и фосфатаз в препарате фермента определяют по способности вессоединения Е со СК-фрагментов ДНК вируса

SA — 7 с помощью ДНК-лигазы бактериофага

14. Полученнай препарат рестриктазы gyp Щ не содержит неспецифических эндонуклеаз, на что указывает полное сохранение суперспиральной структуры плазмидной ДНК pBR 322, не содержащей сайтов, узнаваемых эндонуклеазой рестрикции Есо СК, при десятикратном избытке фермента и длительной инкубации. Полученный препарат фермента полностью лишен экзонуклеаз и фосфатаз, так как Е,со СК-фраг менты ДНК способны соединяться с помощью

ДНК-лигазы. Все это указывает на то, что данный препарат фермента может быть использо41 4 ментов ДНК, содержащих сайт узнавания для исследуемого фермента. Анализ совпадающих нуклеотидных последовательностей различных фрагментов ДНК позволяет установить, что сайт узнавания рестриктазы Е со СК являет- ся вырожденной прерывистой несимметричной последовательностью нуклеотидов: т(), с с(й),с(и)за.

Компьютерный анализ последовательной ДНК

pBR 322, SY — 40 н gK 174 подтверждает отсутствие такого сайта узнавания в указанных

ДНК, устойчивых к действию фермента. Указанная последовательность нуклеотидов, равно как и характер фрагментации тесторных ДНК. отличается от таковых дпя всех известных рестриктаэ. Согласно существующей номенклатуре данная рестиктаэа обозначена. E со СК.

Количество сайтов узнавания на разных гесторных ДНК для рестриктаз, имеющих 4 сайта узнавания на ДНК фага 3,, приведено в таблице.

ЕсоСК

26

x„„„v (pygmy)

xot и 9vU3) 0

Использованный штамм не содержит посторэнней микрофлоры и по тинкториальным свойствам является грамотрицательной палочкой.

При рассеве па чашке с 1,3%-иым массопеп- тониым агаром рост в виде отдельных мелкозернистых колоний в 8-форме с. равными краяья%.

Таким образом, доступность выращивания больших количеств биомассы, простота процеду 40 ры выделения фермента (две стадии колоноч. ной хроматографии вместо обычных 3 — 5), высокая удельная активность и чистота получен, ного ферментного препарата, уникальная узнаваемость последовательности нуклеотидов и повышенная чувствительность фермента E со СК

45 и ДНК вирусов животных позволяют широко испольэовать этот фермент как уникальный инструмент в молекулярно- биологических, генно-инженерных и структурных исследованиях вообще и геномов аденовирусов человека и животных в частности.

Характеристика штамма с;. ссЖ Q(Штамм Я.с ф С является иепатогенным вариантом кишечной палочки и выделен в

1954 году. Изучен только в. СССР.

ВНИИПИ Заказ 11154/29

Штамм неподвижен, сфаживает глюкозу с образованием кислоты и газа, сбраживает мальтозу, рамнозу, сорбит, кснлозу, арабинозу с образованием кислоты, образует индол и не образует сероводорода.

Неполидиногенен, но обладает множественной устойчивостью к антибиотикам.

Содержит плазмиды.

Продуцирует рестриктаэу Е со CK.

Тираж 525 Подписное

Ужгород, ул.Проектная,4

Филиал ППП "Патент", г

3 10670 ван в эксперимейтах по генетической инженерии и структурных исследованиях ДНК. Полученный препарат фермента — специфическая эндонуклеаза рестрикции Е со СК превосходит лучшие образцы зарубежных коммерческих препаратов (фирмы "Берннгер", ФРГ, "Sigma", США) — ферментов данного класса по удельной активностями соответствует им по степени очистки. Данная рестриктаза имеет четыре точки расщепления на ДНК бактериофага лямбда и отличается от всех описанных в литературе ферментов данного тила по характеру фраг, ментации тесторных ДНК (см. таблицу); ДНК фага Х 174, плазмнды рВА 322 и вируса

SV- 0 ферментом Е со СК не расщепляются.

Особенностью фермента является его уникальная чувствительность к адеиовирусам человека и обезьян. ДНК аденовирусов типа 1 2,5,6 и 7 имеют не менее 10 точек расщепления для рестриктазы Q,ñî0i ÑÊ. Для идентификации последовательности узнавания данной рестриктазой использован метод секвенирования фраг