Способ получения иммобилизованных клеток,обладающих глюкозоизомеразной активностью

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, путем смешивания клеток с раствором полисахаридного гелеобразователя и последующего выдерживания смеси в растворе соли, отличающи йс я тем, что, с целью повышения глюкозоизомеразной активности и упрощения процесса, на стадии смешивания клеток с полисахаридным гелеобразователем вводят соли металловак-ткваторов и КгО в концентрациях 0,02-2,5% при следующем соотношении компонентов (в расчете на сухие вещества) клетки полисахаридный гелеобразователь 1:(О ,8-1,25 ) , в качестве полисахаридного гелеобсл разователя используют полиурониды, а вьвдеркивание смеси проводят в растворе 0,08-0,12 М хлористого кальция.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ (21 ) 3498451/28-13 (22 ) 20.08.82 (46) 30.01 84. Бюл. 9 4 (72 ) Е.Г1 Мурина, Л.A. Нахапетян, И.Г. Плащина, Е.Е. Браудо, В.И. Мисюрев и В.Б. Толстогуэов (71 ) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический»институт и Ордена Ленина институт элементоорганических соединений им. A.Н. Несмеянова (53) 577.15(088.8) (56) 1. Cheetham P.S.,1., Blunt К.W., Bucke С, Physical studies on cell

immobilization usinp calcium alginate 8els. Biotechnal and Biolnp., 1979, 21, В 12, 2155-2168.

2. Патент COLA Р 4138292, кл. С 07 G 7/02, 1979.

М51) 1 2 N 11 0 4 С 1 2 )l 9 9 2 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, ОБЛАДАЮЩИХ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗНОИ АКТИВНОСТЬЮ, путем смешивания клеток с раствором полисахаридного гелеобраэователя и последующего выдерживания смеси в растворе соли, о т л и ч а ю щ и й-. с я тем, что, с целью повышения глюкоэоизомеразной активности и упрощения процесса, на стадии смешивания клеток с полисахаридным гелеобразователем вводят соли металлов+Я активаторов Со и Мяо в концентрациях 0,02-2,5% при следующем соотношении компонентов {в расчете на сухие вещества) клетки полисахаридный гелеобраэователь 1г(0,8-1,25), s в качестве полисахаридного гелеобразователя .используют полиурониды, а выдерживание смеси проводят в растворе 0,08-0,12 М хлористого кальция.

107016 3

10

30

60

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам иммобилизации клеток, обладающих ферментативной активностью, и может быть использовано при производстве глюкоэофруктоэного сиропа.

Известен способ получения иммобилизованных клеток Saccharomyces

uvarum с использованием полимерных гелей на основе альгината натрия.

Суспензию клеток смешивают с 1-2%ным раствором альгината натрия, затем прибавляют по каплям"в 0,080,1 И раствор СЭ,С1 и дубят в растворе этой соли при 30 С.

Преимуществами способа являются высокая механическая и термическая стабильность препаратов иммобилиэованных .клеток вследствие возникновения ионно-координационных связей между макромолекулами альгйната и ионами Са L 1l, Однако способ невозможно исполь.зовать для иммобилизации клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, так как обработка геля солями Са приводит к ингибированию .глюкоэоизомеразы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилиэованных клеток, обладающих глюкоэоиэомераэной активностью, путем смешивания клеток с раствбром полисахаридного гелеобразователя и последующего выдерживания смеси н растворах солей металлов„ например калия. При осуществлении способа клетки, обладающие активностью глюкоэоиэомераэы, включают в матрицу полисахаридного гелеобразователя типа фурцеллорана, каррагинана или сульфата целлюлозы с последующим формованием и выдерживанием препарата иммобилиэованных клеток в растворах солей металлов с атомным весом выше 23. Для придания полученному препарату механической прочности и термостабильности его подвергают дополнительной обработке в растворах солей и обработке различными органическими сшивающими агентами (глутаровым альдегидом, глиоксалем, диоксиацетоном, эпихлоргидрином и др.). Остаточная активность полученного препарата составляет 35% от активности исходных клеток L2)..

Недостатками известного способа являются снижение активности глюкоэоиэомераэы после обработки препарата иммобилизованных клеток различ. ными органическими сшивающими агентами на 20-25Ъ, необходимости использова«ия в качестве гелеобразователя гелей типа фурцеллорана, каррагинана, агароида, которые обладают недостаточной прочностью (для повышения прочности требуется дополнительная обработка), а также сложность технологии получения препаратов, так как требуется дополнительная обработка препаратов растворами органических сшивающих агентов для обеспечения механической и термической прочности, Кроме .того, использование в качестве гелеобразователя полисахаридов типа альгината, ниэкоэтерифицированного пектината и лизостерата калия, натрия или аммония невозможно, так как при выдерживании в солях, указанных в известном способе, например в солях калия, гель не образуется, а при выдерживании в солях кальция, происходит ингибирование глюкозоизомеразы.

Цепь изобретения — повышение глюкозоизомеразной активности иммобилизованных клеток и упрощение способа.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилиэованных клеток, обладающих глюкозоиэомераэной активностью, заключающемуся в смешивании клеток с раствором полисахаридного гелеобразователя и последующем выдерживании смеси в растворе соли, на стадии смешивания клеток с полисахаридным гелеобраэователем вводят соли металлов-активаторов Со и 08 в концентрациях 0,02-2,5Ъ при следующем соотношении компонентов (в расчете на сухие вещества) клетки: полисахаридный гелеобраэователь

1:(0,8-1,25), в качестве полисахаридного гелеобразователя используют полиурониды, а выдерживание смеси проводят в растворе 0,08-0,12 М хлористого кальция.

При использовании изобретения подавления активности глюкозоиэомеразы под действием ионов Са не наблюдается. Причина этого явления заключается в том, что ионы-активаторы, введенные на стадии смешивания, прочнее связываются с активным центром фермента, чем ионы Са+

Использование указанного приема позволяет устранить неполноту проявления активности глюкоэоиэомеразы, которая возникает вследствие затруднения процесса диффузии ионов металлов-активаторов к клеткам после иммобилизации.

При использовании в качестве полисахаридного гелеобразователя типа альгината, ниэкоэтерифицированного пектината или зостерата калия, натрия или аммония, а в качестве солей в дубильном растворе — соли кальция пищевых кислот между молекулами полисахаридных гелеобразователей и ионами Са + возникают конно-коорди-.

1070163 национные связи, наиболее прочные, чем водородные связи (как в прототипе при использовании в качестве полисахаридного гелеобразователя типа фурцеллорана, каррагинана и агароида, а в качестве солей в ду- 5 .бильном растворе — соли калия пищевых кислот). Это позволяет получить более стабильные(механически и термически) препараты беэ дополнительной обработки органическими сшива- 10 ющими агентами (обработка этими агентами ведет к падению активности, как в прототипе), что приводит к упрощению технологии получения препаратов. 15

Пример 1.-3а единицу активности глюкоэоиэомеразы принимают количество фермента, катализирующее иэомеризацию одного микромоля субстрата (глюкозы) в фруктозу при . 2„ рН 7,0 и температуре 70 С эа 1 мин.

Для измерения активности. глюкоэоизомеразы навеску препарата иммобилиэованных клеток (0,15-0,2 г) помещают в 10 мл раствора 2 М глюкозы, инкубируют 10 мин при 70 С при

d постоянном перемешивании.

Клетки Act. alhopriseolus (5 r), полученные после;центрифугирования культуральной жидкости и обладающие активностью 57,3 ед/г влажной биомассы, смешивают с 5 г 4%-ного альгината натрия, предварительно нагретого до 70 С. В иммобилиэационную ячейку добавляют 2,5%СоС1-6Н2 О и 2,9% -"M@SO„. 7Н20. Смесь продавливают через фильерй диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,1 М раст. вору СаС12 и дубят 2 ч при 30 С.

Активность влажного препарата ед/г, что составляет 250Ъ по 40 сравнению с контрольным препаратом.

ГИА контрольного препарата, полученного по способу-прототипу, составляет 20,6 ед/г влажного препарата и принята эа 100%. 45

Пример 2. Клетки Act. olivocinereus (5 r), полученные после центрифугирования культуральной жидкости и обладающие активностью

57,3 ед/г влажной биомассы, смешива- 5р ют с 5 г 5%-ного ниэкоэтерифицированного пектината калия, предварительно нагретого до 70 С. В иммобилизационную ячейку добавляют 1, 2% Со С1<. 6+.0 и 1,2% N MSSOg 7H20. Смесь пРодавли- 55 вают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,08 М

Ф раствору Сас1 и дубят 2 ч при 30 С.

Затем измеряют активность глюкозоиэомераэы. Активность препарата

46,4 ед/г влажного препарата, что составляет 223% по сравнению с активностью контрольного препарата.

Пример 3. Клетки Act albogriseolus (5 r) полУченные после цент.рифугирования культуральной жидкос- 65 ти и обладающие активностью глюкоэоизомеразы 57,3 ед/г влажной биомассы, смешивают с 5 r 6Ъ-ного зостерата аммония, предварительно нагретого до 70 С„ В иммобилизационную ячейку добавляют 0,02Ъ СоС1 6Н>0 и 0,02%

MpSO<.7H@0. Смесь. продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,12 М раствору Сас1 и дубят 2 ч при 30 С. Активность полученного препарата 43,2 ед/г влажного препарата, что составляет 207% по сравнению с активностью контрольного препарата.

Пример 4. 1бтетки Act. albo ;riseolus (5 r), полученные после центрифугирования культуральной жидкости и обладающие активностью

57,3 ед/г влажной биомассы, смешиьают с 5 r 5%-ного альгината калия, о предварительно нагретого до 70 С.

В иммобилизационную ячейку добавляют

Сос1 6Н О и 1,2% М С1 6Н

Смесь продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0,1 М раствору Сас1 и дубят

2 ч при 30 С. Активность полученного препарата 41,3 ед/г влажного препарата, что составляет 200% по сравнению с активностью контрольного препарата.

Пример 5. Клетки Act olivocinereus (5 r), полученные после центрифугирования культуральной жидкости и обладающие активностью

57,3 ед/г влажной биомассы, смешивают с 5 г 6%-ного ниэкоэтерифицированного пектината натрия, предварительно нагретого до 70 С. В иммобилиэационнуи ячейку добавляют 1,2Ъ СоБО„

7Н 0 и 0,02Ъ Mp;SOq- 7HgO. Смесь продавливают через фильеры диаметром 3 мм или прибавляют по каплям к 0 08 M раствору Сас1 и дубят 2 ч

I при 30 С. Активность полученного препарата 40,6 ед/г влажного препарата, что составляет 195% по сравнению с активностью контрольного препарата.

Таким образом, предлагаемый способ получения препаратов иммобилизованных клеток, обладающих глюкозоизомеразчой активностью, позволяет, во-первых, увеличить ферментную ак» тивность препарата иммобилизованных клеток на 95-150% при сохранении механической и термической стабиль- ности; во-вторых, использовать в качестве гелеобраэователей не только сульфатированные галактаны, такие как фурцеллоран, каррагинан, агароид, но и карбоксилсодержащие полисахаридные гелеобразователи (альгинат, низкоэтерифицированный пектинат, зостерат), что способствует упрощению технологии получения препаратов иммобилиэованных клеток и обеспечивает их механическую и термическую

1070163

Составитель В. Муронец

Редактор A. Курах Техред И.Метелева Корректор Л. Патай

Заказ 1„1643/27 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 стабильность; в-втретьих, сократить технологический цикл процесса при

Эксплуатации препаратов иммобилизованных клеток, исключив стадию очистки глюкозофруктозного сиропа от ионов Со и Mg+ вследствие прочного связывания ионов-активаторов с ферментом; в-четвертых, сократить расход дорогостоящих металлов-активаторов, так как исчезает необходимость добавлять их в каждую партию субстрата.

Кроме того, .ожидаемый экономический эффект от использования предлагаемого способа получения иммобили5 зованных клеток, обладающих глюкозоизомеразной активностью, составит

24 356 тцс.руб. на 1 т препарата, а годовой экономический эффект— ,306 тыс. руб.