Способ определения активности ферментов,синтезирующих или разлагающих аденозинтрифосфат

 

СаОЗ авЕтСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

g? C;,»»

1 б

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ °

Нб:.;1

- .-."- ббббЪ ,3С

"б б

8t щ,wr(i d l

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

fl0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЬЙ (21) 3407340/28-13 (22) 12.03.82

46) 30.01.84. Бюл. 9 4 (72) 3).Ю. Кулис, N.Â.Ïåñëÿêåíå;.

В.-С. A. Лауринавичус и В.В.Кулене (71) Институт биохймии AH ЛитССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии

453) 577.15 (088.8) . (56) 1.Вове J.А., Colowich S.P. and

Kepi

2.Бровко Л.Ю., Угарова Н.H. и.др. Применение иммобилизированной люциферазы светляков для количественного определения АТФ и ферментов,, синтезирующих и разлагающих АТФ.—

"Биохимия", 1978, т. 43, вып, 5, с. 798 — 805 (прототип).

3.."Журнал аналитической химии", 1980, т. 35, 9 6, с. 1168.,ЯО„„1070166 А

345ВС 12 9. 1/00; С 12 И 9/12 б.54) (57) 1.СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ ИЛИ

РАЗЛАГАЮЩИХ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТ, включающий взаимодействие фермента с субстратом в буферном растворе и регистрацию изменения одного иэ параметров.системы с последующим определением активности фермента в зависимости от величины измеряемого параметра с помощью калибровочного графика, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, при взаимодействии фермента с субстратом осуществляют электролиз реакционной смеси в присутствии ферментных электродов на основе глюкозооксидаэной или глюкозооксидаэной и Ъексокннаэной мембран

З ь в. присутствии глюкозы и аденоэин- / и дифосфата или аденоэинтрифосфата ЪУ Ф и по уменьшению анодного тока опре- С" деляют активность фермента.

iieet

2. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют

0,01 M трис-НС5 буферный раствор, содержащий 2-5 мИ Mq6+ .

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что в качестве фермента используют пируваткиназу, в качестве субстрата - смесь 0,250,5 мИ фосфоенолпирувата, 0,250,5 мИ аденозиндифосфата и процесс ведут в присутствии ферментного электрода с глюкозооксидазной и гексокинаэной мембранами. г

4. Способ попп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что в качестве

1070166 фермента используют ацетаткинаэу, в качестве субстрата - смесь 0,51,0 мМ ацетатфосфата, 0,25-0,5 мМ аденозиндифосфата и 0,1 мМ глюкозы и процесс ведут в присутствии фер-ментного электрода с глюкозооксидазной и гексокиназной мембранами.

5. Способ по пп. 1 и 2, о т л и-. ч а ю шийся тем, что в качестве фермента используют гексокинаэу, в качестве субстрата - смесь 0,25 мМ аденоэинтрифосфата и 0,1 мМ глюкозы и процесс ведут в присутствии ферментного электрода с глюкозооксидазной мембраной.

Изобретение относится к электрохимическим методам анализа, к способам измерения или испытания, использующим ферменты, конкретно оксидоредуктаэу и трансферазу, и может быть использовано для обнаружения киназ в растворах и для определения их активности.

Известен колориметрический способ определения активности ацетаткиназы 511, включающий обработку исследуемого образца раствором, содержащим 3,2 МСН СООК, 1 М трис-HCO pH которого 7,4, 1 И NqCOg, 3,5 М КОН, 28% н: Н ОН * НС1, 01 М ATC (натриевая соль нейтрализована с НСй ), 1, 25%

FeClg в 1 н. НС1 (2 r FeCl 6HQ в 100 мя

1 н, HCC), 10% ССС СООН. Цвет получают, добавляя 4. мл еС0, оптическую плотность измеряют при 540. нм. Активность ацетаткиназы вычисляют из формулы

Ь ° 38,7

A/мг (мл)

+ мг(мл где Э вЂ” полученная оптическая плотность при

540 нм, 38,7 — коэффициент, время инкубации, Е „ - количество фермента в мг или мл, внесенного в реакционную среду.

Однако в этом способе необходимо применять, только прозрачные, неокрашенные. образцы, аппаратура колориметрического Определения дорогая, необходимо использовать много реагентов. Кроме TGlo, метод не обладает достаточной селективностью.

Наиболее близким к предлагаемому является биолюминесцентный способ определения активности ферментов, 2 синтезирующих или Разлагающих АТФ, включающий взаимодействие фермента с субстратом н буферном растворе,измерение интенсивности биолюминесценции с пОследующим определением активности фермента в зависимости от интенсивности биолюминесценции с помощью калибровочного „графика.

В качестве буфера обычно исполь10 эуют 0,02 М трис-.ацетатный буфер, рН 7, 75, содержащий 2 мМ ЭДТА, в качестве фермента — люциферазу, а Ю качестве субстрата — люцифе рин l2l и (3).

Однако в известном способе применяется дорогостоящая аппаратура, так как концентрацию люциферина определяют спектрофотометром, а интенсивность биолюминесценции измеряют на сконструированной в лаборатории установке, содержащей кюветное отделение с дорогостоющими кюветами.

Цель изобретения — упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности ферментов, синтезирующих или разлагающих аденозинтрифосфат, включающему взаимодействие фермента с субстратом в буфернсм растворе и регистрацию измерения одного иэ параметров системы с последующим определением активности фермента в зависимости от величины измеряемого параметра с помощью

35 калибровочного графика, при взаимодействии фермента с субстратом осуществляют электролиз реакционной смеси в присутствии ферментных электродов на основе глюкозооксидазной

4{3 и .глюкозооксидазной и гексокиназной мембран:: и в присутствии глюкозы и аденоэиндифосфата или аденозинтрифосфата и по уменьшению анодного тока определяют активность фермента.

1070166

В качестве буфера используют. 0,01 М трис-НС1 буферный раствор« содержащий 2-5 мМ М ЗО .

В качестве фермента используют пируваткиназу или ацетаткинаэу в качестве субстрата смесь 0,25 — 0,5 мМ фосфоенол= пирувата или 0,5-1,0 мМ ацетатфосфата, 0,25-0,5 мМ аденоз ндифосфата и 0,1 мМ глюкозы и процесс ведут в присутствии ферментного электрода с глюкозооксидазной и гексокиназной мембранами.

В качестве фермента может быть также использована гексокиназа, тогда в качестве субстрата используют смесь 0,25 мМ аденозинтрифосфата и 0,1 мй глюкозы и процесс ведут в присутствии ферментного электрода с глюкоэооксидаз ной мембраной .

На чертеже дан калибровочный график зависимости ферментативной реакции от концентрации.

Способ включает операции погружения электрода с глюкоэооксидазной и гексокиназной или глюкоэооксидазной мембранами в термостати.руемый буферный раствор и раствор субстратов, проведения электролиза, при котором регистрируют стационарный ток, вводят раствор ферментов, регистрируют уменьшение тока при

0,6 — 0,7 В относительно +/AqCt. электрода в течение 4-10 мин, после чего расчитывают ферментативную активность исходя из тангенса угла наклона кинетической кривой уменьшения тока в первые 4-5 мин. Калибрование электрода проводят после трех определений активности.

Способ основан на использовании ферментных электродов.

Для определения активности ферментов, разлагающих аденоэинтрифос-. фат,. например гексокиназы, используют глюкозный электрод, принципиальная схема изготовления которого известна (31 . Он состоит иэ теплового корпуса, в который вмонтированы платиновый анод и A

Для определения ферментов, синтезирующих аденозинтрифосфат, например пируваткиназы и ацетаткиназы, используют АТФ чувствительный электрод. Последний изготавливают также по известной схеме t33, только анод покрывают тремя мембранами: глюкозооксидазной, капроновой сеткой, поры которой заполнены суспензией гексокиназы, и внешней диализной.

Способ определения основан на следующих ферментативных превращениях.

Под действием глюкоэооксидазы окисляется глюкоза, образовывается

Н О, а злектрохимическое окисление .последнего при +0,6 В относительно электрода сравнения (насыщенный

5 Aq/AgCtj генерирует анодный ток: глюкозооксидаза, глюкоза +0 глюконолактон + И О .

При наличии гексокиназы и адеио1р зинтрифосфата параллельно протекает фосфорилирование глюкозы с образованием аденозиндифосфата АТФ гексокинаэа глюкоза + АТФ, Й

15. глюкозо-б-фрсфат + АДФ.

Изменение концентрации глюкозы в отсутствии и при наличии в системе АТФ обуславливает разность в

20. значениях величин анодного тока., Угол кинетической кривой отражает скорость ферментативной киназной реакции (разложение или образование

АТФ).

25 Пируваткинаэа при наличии в среде своих субстратов — фосфоенолпирувата и аденозиндифосфата катализирует реакцию пируваткиназа (0,32

«10 (5,5

Гексокинаэа (4,3

»1 0-3 б; 6)» ед/мл, 19, 6)« ед/мл, 23, 4)» ед/мл.

3р 4 E + АДФ пируват + АТФ« скорость которой пропорциональна активности фермента, выраженной в ед/мл.

Из экспериментально получаемой .величины скорости уменьшения тока (1 »„- нА/мин ) и ответа АТФ— чувствительного электрода на стандартную концентрацию АТФ (0,1 мМ) вычисляется скорость ферментативной реакции (скорость образования АТФ

40 мкмоль/мин1 и удельная активность пируваткинаэы в ячейке. Из построен-. ного калибровочного графика (концентрация фермента — скорость ферментативной реакции можно высчитать оп45 ределяемую активность ферментного препарата (Е/мг белка1 .

Ацетаткиназная реакция аналогична пируваткинаэной, только в качестве донора фосфатной группы выступает

50 ацетатфосфат.- Определение ферментативной активности аналогично.

Для определения ферментативной активности .гексокиназы используется значенце ответа ь1(нА) глюкозного

55 электрода на 0,1 мМ глюкозы.

При определении активности в реакционную смесь вводят фермент с активностью в определенном интервале

1070166

55 пируват + АТФ

ФЕП + АДФ

15. ° 10 мкмоль/мин

А = Aqua

2 ° 102 мг

0,75 Е/мг белка.

Активность вычисляется из данных эксперимента, т.е. из угла наклона кинетической кривой изменения тока.

Это связано с тем, что в данных интервалах активности ферментов наблюдаются прямолинейные зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента. Поэтому определение активности возможно только тогда, когда активность исследуемых киназ находится в укаэанных интерва- tO лах.

Для этого исследуемые ферментные растворы в необходимых случаях разбавляют до нужной концентрации, обеспечивающей соответствующую ак- 15 тивность

Преимуществом предлагаемого способа является значительное упрощение процесса по сравнению с извест,ным, так как он основан на использовании более простого оборудования, не требует дефицитной импортной аппаратуры, кроме того, обеспечивает возможность автоматизации процесса, что расширяет его технологические возможности.

Пример 1. Определение ферментативной активности пируваткиназы "Реанал".

В ячейку помещают 0,01 М трис-НС1 буфер,.2 мМ MqSO 0,25 мМ

АДФ и 0,25 мМ фосфоеыолпирувата.

В полученный раствор при 25 С погружают ферментный электрод с глюкозооксидазной и гексокиназной.мемб-ранами, подключенный к полярографуLA-7 с самописцем. Затем добавляют 0,1 мМ глюкозы. Общий объем раствора в ячейке составляет 10 мл.

Начинается .ферментативное окисление глюкозы с последующим электро- 40 химическим окислением на Р1 выделяющегося Н,О при потенциале 0,6-0,7.

В относительно насыщенного электрода сравнения +/А С6 и генерацией анодного тока 45 глюкоза + 0 --- 8 = глюконолактон + Н С, Н О вЂ” О> + 2Н+ + 2е

Записывают стационарный ток в течение 1 мин. Вводят 9,68 мкг исследуемого фермента — пируваткиназы (ПК1 . Последняя при наличии в среде субстратов — аденозиндифосфата (АДФ) и фосфоенолпирувата ФЕП катализирует реакцию скорость которой пропорциональна активности исследуемого фермента.

Сопоявлением в растворе аденозинтрифосфата (АТФ) начинается реакция фосфорилирования глюкозы 65 глюкоза + АТФ вЂ” глюкозо-6фосфат + АДФ.

Следовательно, уменьшается концентрация глюкозы в растворе и уменьшается анодный ток, Самописец регистрирует скорость уменьшения анодного тока в течение 4 мин, которая составляет 0,5 нА/мин (a3) .

Аналогично измеряют npa pyгих концентрациях фермента ПК, чтобы получить статистически достоверную величину определяемой активности (19,36, 29,04; 51,04; 73,04; 85,0;

99,5- и 120,0 мкг в 10 мл раствора).

Полученные величины ьЛ приведены в табл. 1.

Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают еще величину уменьшения тока при использовании стандартного раствора, содержащего 100 мкМ АТФ в 1 л (ответ электрода на 100 мкМ АТФ).

Затем вычисляют скорость ферментативной реакции,, которую выражают в мкмоль/мин в объеме ячейки 10 мл,, удельную активность фермента в 1 мл, которую выражают в ед/мл, и удельную активность фермента ПК (Е/мг белка).

Расчеты величин скорости ферментативной реакции

100 мкМ вЂ” 82,5 нА

Х вЂ” 0,5 нА/мин

Х = 0,6 MKM/мин в 1 Jl) 0Таким путем получают скорость реакции в объеме 1 л. Отсюда следует, что скорость реакции в объеме

10 мл 0,6 ° 10 мкмоль/мин, а удельная активность ПК в 1 мл. — 0,6

<10 ед/мл.

Аналогично вычисляют эти параметры для других концентраций ПК, которые приведены в табл. 1.

Расчеты удельной активности фермента ПК в Е/мг белка. Строится калибровочный график зависимости ферментативной реакции от концентрации (см.чертеж).

Видно, что за пределами указанного интервала значений активности концентрации фермента) изменение скорости ферментативной реакции больше не фиксируется (на графике после ние две точки) . Поэтому эти концентрации нс могут быть учтены при расчете определяемого параметра.

Для расчета активности фермента из тангенса угла наклона берут любые две точки калибровочной кривой, полученной в интервале концентраций 9,68 - 85,0 мкг в 10 мл раствора.

7 10701

Аналогично, исходя из других концентраций и величин скорости ферментативной реакции, получают следующие активностиг 0,62, 0,75, 0,80 и 0,78. Средняя достоверная величина, полученная при использовании 5 пяти концентраций, составляет

0,71 Е/мг белка что совпадает с величиной, вычисленной из тангенса угла наклона калибровочной кривой).

Пример 2. Определение фер- 10 ментативной активности пируваткинаэы КасИ- Light Ub

Ферментативный электрод с глюкоэооксидаэной и гексокиназной мембраной погружают в 0,01 М трнс-HCt c

2 мМ NqSOq буфер,s качестве субстрата берут 0,5 мМ АДФ и 0,5 мЕ фосфоенолпирувата, 0,1 мМ глюкозы при

25 С. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор

0,32-10 ед/мл пируваткинаэы, после чего записывают уменьшение анодного тока в течение 4 мин из-за продуцирования в системе АТФ.

Активность пируваткиназы вычисляют аналогично примеру 1.

Экпериментальные данные приведены в табл. 1.

П р н ме р З.Определение ферментативной активности ацетаткинаэы"Сигма".

Ферментативный электрод с глюкоэоооксидазной и гексокиназной мембранами погружают в 0,01 М трис-НС с 4 мМ Мс бО буфер, в качестве субстрата применяют 0,5 мМ АДФ и

1, О мМ -ацетатфосфата, О, 1 мМ глюкозы при 25 С. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор 5,5 ° 10 ед/мл ацетаткиназы, после чего записывают уменьшение анодного .тока в течение 4 мин из-за 40 продуцирования в системе АТФ.

Ак тив ность ацетатки на зы вычисляют аналогично примеру 1.

Экспериментальные данные приведе- 4 ны в табл. 2.

Пример 4. Определение ферментативной активности ацетаткиназы

ВНИИ прикладной энзимологии.

Ферментативный электрод с глюкозооксидаэной и гексокинаэной мембранами погружают в 0,01 M трис-HCP c мМ М ЗО» бУфеР, в качестве субстрата применяют 0,25 мМ АДФ и 0,5 мМ ацетатфосфата, о,1 мМ глюкозы при .

25 С. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор

6,6 ° 10 ед/мл ацетаткиназы, после чего записывают уменьшение анодного тока в течение 4 мин из-за продуцирования в системе АТФ.

Активность ацетаткиназы вычисляют аналогично примеру 1.

Экспериментальные данные приве-. дены в табл. 2.

Пример 5. Определение ферментативной активности гексокиназы.

Ферментативный электрод с глюкоэооксидаэной мембраной погружают в 0,01 М трис-HCC с 5 мМ QSOq буфер, в качестве субстрата применяют

0,25 мМ ATC и О;1 мМ глюкозы при

25 С. Записывают стационарный ток в течение 1 мин, вводят раствор

4,3 ° 10 ед/Мл тексокиназы, после чего записывают уменьшение анодного тока в течение 4 мин, которое имеет место из-за фосфорилирования глюкозы

АТФ, каталнзируемого гексокнназой.

Активность гексокинаэы вычисляют аналогично примеру 1.

Экспериментальные данные приведены s табл. 3.

Из табл. 3 видна линейная зависимость скорости уменьшения концентрации АТФ от количества введенной гексокинаэы.

По сравнению с известным предлагаеьий способ определения активности ферментов, синтезирующих или разлагающих АТФ, является простым, так как отсутствует необходимость выделения люциферазы и использования специальной люминесцентной аппаратуры, которая не выпускается в нашей стране. При этом значительно ускоряется процесс определения, так как отсутствуют операции предварительной обработки образцов и приготовления реагентов. Кроме того, расширяются технологические возможности определения, так как процесс определения можно проводить непрерывно, например, в ходе бносинтеза ферментов, определение легко автоматизировать. При одной заправке электрода гексокинаэной в течение трех дней можно проанализировать около 1000 образцов. Перемонтаж электрода занимает около 20 мин, а в случае измерения активности гексокинаэы, где используатся ферментативная глюкозооксидазная мембрана, электрод можно использовать в течение трех месяцев.

1070166

10 м (Ю

»-» с ф е

Ц Е»

0 С а !

» Я х

Э !

Ol Ю ою ! ОСО

Фw щ н э о х О C(О (»»»»» с 5

Ц (Ю

»-(о о

% (Г о

»-г о

» !

C(»»

LO О(с с (O C(»-» л г 1

«» (О с ! (-»

I г 1

ul 1 м 1Э!!

1 Н( гч ! г 1

1 ! о

° (!(1

1О О с с о о

Ц

1 !

„!!

1 о о

»-» г (d I

xc(I

Ю 1

Н»-! 1

Ф 1

Д Е I н Е4 сiх

Ю с гч (гг с

N х

Х I !

До 1(О

) ц»-» (с(0 !о

Е Д I о

Ch LA

Ю г 1

»»»» с о о (О г»

»-(\

C(I

1 ! !

1 !

1«Ч

1г )

C(Ю с

С(до Ц»

% щ сг(!

1О 01

Ю Ю о о с с о о

Ю

C( гЧ

Ю с о

C( гг! гч

Ю с

Ю (г) г(ъ

Ю. с

X О

Х г(0

0 гЧВ с !»

О (d

Ж ж -е э х х

- Е

Г7 «! гч

»! g

1 гч

«О с

СО О о с ((3(I

1

1

1

1 !

1 гч ! гЪ 1; 7 (г((i(t с

21 ЮО щ

Фх1.0 в д

I х 1Л !цс*! х х Цл (г! ld гч аан но х х

Ф Э

NN(d ххн

00 Э ххв

x ° с

Е и

»\ (х х

Ig

00 д х н х

0Е! х 6я х д

Ц Х с о а

ХИ< 3(!

«О Ch с с о о о с

» Ч с

Ю в

I

1 (г! I

cl (О с с

rI LO

0(I н х t

Ф -1 ."5 1 х t

Х д х

Но о х е х

Э х ц

1 Э

0 щ

Ю Ln о с с О О

»-»

lA г() с г«) (г) сО

LO

»» м м

1 о о

»-» ((Г с це

0С

o, Ф Х

Ц XC(Ю н ю

Э»-» ф

О х

Х щ

I Д х ц

ld Ф

Ц х ъ (0Х

2»d

CO с о а (-»

1 (d д 1 н

ХОЦ эое х х (»(\ c о

»-! «»

1 о

»-»

« гЧ гЧ с с

»-! N LO

« о|! о со

Ю гг( (» \ ( с с о о

1 !

1 !

X l

Э 0

Х х о гЧ ГЧ

«-» (Ч ю о с с о о (О

Ю

С:( (! г(Ю с

C) О (О о с

C) с (-(I

1

1 г") (г1 с л

1 (г) гЧ с

»-! «Ч со с с

»»» сО г() с г(1 сг( (О с \

CO ГЧ

\»

Е !

» х е и !Ц с аг(»-»

C(Ю

»-»

1 о о с . I

1 и (Э

ld XМ щхх (d Й ° «5 хам х 0»а

Х Н Н (d

»3

1 1

1 ДCd н 0

0ХС

1 Эхх » Ф Е

Ц g c о щи

1 I(d Q(X

IL с

1 Ц 1 г(О с (с1

l (О !» г() О

\ с

Ch О1 (.» «Ч

"(г(Ю с (!

I td (г! ха

I tdf

1 Ф х

1 О» Э в «1

1Мо

-I ИХ

Lfl с

»Ч

1 (Л

CO

I

1 нххн (г! Э Э (г!

Й $в

exxv

Ц000

<ивов

Ю in с а хх 1 и 1,Ф 1 д I Сг»Х l -» « а х

"l XO

1 t= Х щ!

x I

1 1 ((»

Ф 1

xl x

Э! fd

Х (г!

4 (d N

Cr O

0 й,рХ Е»

I Э ((I ! гг! я

I Х ! н

I Ф до

1.Н Ю

l O

1

1

Ф

0 х

o,õ х вхх 3 х

4 (d « ЦО нного» l

1 Р( с оxvõщz !с

2@оееыщ!

l д х,аz a,z

-4

1 I ! I х 1 гЧ 1 с («с I Ю

Ю I (л ! с х IQ

t(Lt 1"

Е l

0

Х I д1

Но «о

0Х Ы1 О

Фхх

Н l »(Э Э О(Х l ц, „ од ЬС

0 !

4щщд

l

Х 1 а 1

1! жхс !

21! щ l (г! 0! (!!! .O) ,X l (d O

LCL l X l

IX! Х Х («) !н t X щ н х! н! (г! д!

Э!

1И1 S (X!

Ф! go!

1х!! н!! Ol V l.—

„,x!!

Щ1 (у(! Х1 гч 1н!! ф1

1 х!

Ol х!! Д1

xl Ю 1Н1

1 (Г!1!

» !, х! г !Э! с Е!

iО 101

Фl е!

Э1

Х1 х!

Ф1 (1Ц1

« !а!

tg l гъ

tO t! 1 Ю!

1

1 м м! о (:С с. !»-»

g (а с

1 — Л! х

Х 1

A . 1

Цо ю

О»

Е 1

М щ 1

1

1 I

I

1

1 х

Х I

Е с с. 1 х г-»! — Ч

»-(CO с

CO

C( (-» (О с

О1

«-» (О

Ch F»

Ю

«0

12

1070166

Таблица 3

Определение активности гексокиназы (ГК) 2,6

3,9

0,075

0,043

0,107 0,141

0,234

Уд ель ная активность .

А, ед/мл 4, 3 ° 10

10,7 10 14,1 ° 10 23,4 ° 10

7,5 10 ..

Составитель О. Скородумова

Редактор A.Êóðàõ. Техред, И.Метелева . Корректор Л.Патай

Эакаэ 11643/27 Тираж 522 Подписное

HHHHIIH Государственного к@мнтета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,. X-35, Рау аская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная,4

Колич ес тв о

ГК в ячейке мкг

v „ мкмоль/мин в 10 мл

I х,з