Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕШ1Я ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, включающий модификацию активированного аминопропшттриэтоксисиланом кремнеземного носителя и последующее связьшание с ферментом, отличающийся тем, что, с целью увеличения активности целевого продукта, модификацию проводят диазотированием активированного носителя 1,9-7,5%-ным раствором азотистокислого натрия и последующего окисления 2-5%-ным раствором перхлората натрия или периодата калия.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(5И С 12 N 11 14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ, (21) 3486754/28-13 (22) 27.08.82 (46) 07.04.84. Бюл. Ф 13 (72) А.В. Брыкалов,. В.И. Ковальков, В.П. Тельбух и С.И. Кольцов (71) Ставропольский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (53) 577.15 (088.8) (56) 1. Кумарев В.П. и др. Иммобилизация .белков и ферментов на альдегидсилохромах, "Биоорганическая химия", 1976, т. 2, N - 5, с. 700-705.

2. Авторское свидетельство СССР Ф 698970, кл. С 12 N 11/18, 1976. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ HHMOBHJIH30ВАННЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, включающий модификацию актизированного аминопропилтриэтоксисиланом кремнеземного носителя и последующее связывание с ферментом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения активности целевого продукта, модификацию проводят диазотированием активированного носителя 1,9-7,5Х-ным раствором азотистокислого натрия и последующего окисления 2-57-ным раствором перхлората натрия или периодата калия.

084300 пилтриэтоксисиланом кремнеземного носителя путем обработки последнего глутаровым альдегидом и последующее связывание фермента (2) .

К недостаткам способа следует отнести невысокую активность целевого продукта (= 50%).

Цель изобретения — увеличение активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных протеолитических ферментов, включающему модификацию активированного аминопропилтриэтоксисиланом кремнеземного носителя и последующее связывание фермента, модификацию проводят диазотированием активированного носителя 1,9-7,5%-ным раствором азотистокислого натрия и последующего окисления 2-5%-ным раствором перхлората натрия или периодата калия.

Химическая модификация осуществляется по следующей схеме:

Г

ОС 2 Н а =,-;-<

HCE

0CgHg

ОС2Н

О

Ф

Π— — Si — Π— Si — (CH>)- C

I н аС2Н> нг- РЮ Н> и — СРЕР11Е Н Ю

Предлагаемая схема реакции подтверждена данными химического анализа продуктов модификации (табл.1) и результатами инфракрасной спектро- 45 скопии исходных и модифицированных кремнеземов.

Оптимальными условиями диазотирования является добавление к активированному носителю 1,9-7,5%-но-50 го раствора азотистокислого натрия (5-20-кратный избыток реагента по отношению к количеству аминопропильных групп) (табл.2). При проведении реакции диазотирования уменьше- 55 ние концентрации раствора NaNOg нецелесообразно, поскольку ведет к значительному количеству аминопро1 1

Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов, которые могут быть использованы в медицинской промышленности для приготовления биопрепаратов.

Известен способ иммобилизации ферментов путем модифицирования поверхности неорганического носителя магнийорганическим соединением в среде абсолютированного эфира с последующим ковалентным связыванием фермента (1) .

Недостатками этого способа являются многостадийность процесса и сложность обработки неорганического носителя магнийорганическим соединением, что ограничивает практическое использование иммобилизованных препаратов в промышленных целях.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов, включающий модификацию активированного аминопроОС2Н5

1.

: — S — Π— S — (СН2)8 -НН2

О С2112 пильных групп, не вступавших в реакцию. Увеличение концентрации NaNO не создает дополнительных преимуществ.

Оптимальный интервал варьирования концентрации раствора NaCIO или KJO< находится в пределах

2,0-5%-ного раствора или 1-6-кратный избыток реагента по отношению к количеству оксипропильных групп носителя (табл.3). Как видно из таблицы, применение для окисления концентрации раствора NaCgO (K30 ) равной 0,6% нецелесообразно, поскольку приводит к значительному количеству непрореагировавших оксипропильных групп. Увеличение концен3 1084 трации ИаС204 (К104) свыше 5 дает тот же эффект, как и при использовании 2-ЗХ-ного раствора.

При иммобилизации на полученных носителях протеолитических ферментов (папаина или пепсина) активность целевого продукта на

30-40Х выше, чем при иммобилизации известным способом (таблица 4).

Пример 1. Получение носи- 10 теля 10 г макропористого кремнезема, высушенного при 200 С, обрабао тывают парами аминопропилтриэтоксилана в течение 3 ч при 120 С в токе

О осушенного газа носителя (воздух), после чего продукт промывают тремя порциями по 50 мл ацетона.К аминированному носителю прибавляют

50 мл раствора iN NaCZ и постепенно добавляют 30 мл 20Х-ного водного 2р раствора ИаМ02(достигается 20-кратный избыток реагента по отношению к аминопропильным группам, необходимость избытка реагента обусловлена неустойчивостью азотистой кислоты, 25 конечная концентрация NaNOg- 7,5X) .

Суспензию выдерживают в течение

60 мин при комнатной температуре, после чего надосадочную жидкость сливают, промывают носитель в 200 мл gg дистиллированной воды. Как видно иэ табл.2 в этом случае 90Х ковалентно связанных с кремнеземом аминопропильных групп при диазотировании превращаются в оксипропильные.

При концентрации NaN0 равной 1,9, количество оксипропильных групп несколько снижается.

К полученному препарату добавляют

50 мл водного раствора, содержащего 2,5 г NaC304(5X-ный раствор) и перемешивают в течение 1 ч. Затем носитель отмывают в 200 мл (4-кратная обработка по 50 мл) дистиллированной водой. Достигается 6-кратный 45 избыток окисляющего реагента по отношению к оксипропильным группам носителя, что обеспечивает, в соответствии с результатами табл.3, практически 100Х-ное превращение данных

50 групп в альдегидные.

К 2 r полученного носителя приливают 30 мл ацетатного буфера рН 4,0, содержащего 0,6 г пепсина. Смесь ос- тавляют в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее надосадочную жидкость сливают, а носитель промывают ацетатным буфером рН 4,0 до отсутствия следов белка в промывках

300 4 водах. Количества пепсина, иммобилиэаваннага на 1 г носителя, равно

66 мг. Иммабнлиэаванный фермент сохраняет 95Х активности по отнашению к нативнаму состоянию.

Пример 2. Аминиравание кремнезема проводят аналогично примеру 1. Для диазатиравания к аминосадержащему носителю прибавляют 50 мл раствора iN HCE н постепенно добавляют 30 мл 10 . †но водного раствора ИаИО2 (достигается

10-кратный избыток реагента, конечная концентрация 3,7i). В саатвечствии с данными химического анализа, также КаК и в примере Р 1, практически 90Х кавалентна связанных с кремнеземом аминопрапильных групп при диазатиравании превращаются в оксипропильные {табл.2). Далее к носителю с оксипропильными группами добавляют 50 мл ваднага раствора, содержащего 1,0 r K.t04 (2X-ный раствор) и перемешивают в течение

1 ч. Затем носитель отмывают в

200 мл (4-кратная обработка по ,50 мл) дистиллированной воды. Дасти1

:гается 2,5-кратный избыток окисляющего реагента па отношению к оксипрапильным группам носителя, что обеспечивает, по данным химического анализа, практически 100Х-Нор превращение дайных групп в альдегидные

К 2 г носителя, полученного по примеру 1, приливают 30 мп фасфатного буфера рН 6,8, содержащего

0,5 r папанна. Смесь перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее надасадочную жидкость сливают, а носитель промывают фосфатным буфером рН 6,8 до отсутствия следов белка в прамывных водах.

Количество папаина иммабилиэаваннаго на 1 r носителя равно 63 мг.

Иммабилизованный фермент сохраняет

82Х активности — а отношению к нативному состоянию.

Как видно из табл.4 предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает увеличение на 30-40 протеолитической активности фермента в иммобилиэаванном состоянии.

Использование предлагаемого изобретения позволяет получать препараты с более высокой активностью, что увеличивает эффектив;ность их использования в технологических нрацессах.

1084300

I Таблипа1

Химический состав продуктов диазотирования окисления кремнеземов с алифатическими аминогруппами бразец после иазотирования

Превращение оксипропильных групп в

5 (СН,,-OÍ-S (CV, ; йН мг-экв/г в мг-экв-r

1 О

-Ф$1 (СН ) Г Н г г альдегндные, в %

-СН -ОН

2 в мг-экв/г в 7.

0,03

0,30

0,33

0,30

100

0,35

0,05

0,31

0,31

100

Таблица 2

Пределы варьирования концентрации раствора азотистокислого натрия

20-кратный

7,5%

0,35

10-кратный

3,7%

0,35

1,9%

5-кратный

0,35

Таблица 3

Пределы варьирования концентрации раствора перхлората натрия или периодата калия

Избыток NaСIOq реагента по отношению к количеству группы

Превращение

-СН -OH групп в

О

-С в7

Концентрация раствора НаСХО или КСЕРО,1

100 б-кратный

0,31

100

2,5-кратный

0,31

Исходный образец первичными али ратическими -NILE группами

l $ i- (СН ) -NH

Содержание

-СН -ОН

2 групп в мг-экв/г

57 (NaCIO<)

27. (K30 )

О,б7 (NaCZO<) Превращение

-CF -NH

2 2 групп в

Образец после окисления NaCIO 1084300

Таблица 4

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов иммобилизации ферментов

Количество акКоличество мг

Количество

Способ иммобиактивного пепсина на 1 r тивного пепсина в Е/г пепсина на

1 мг носи теля (по булку) лизаций носителя

Известный

53,9

831

41,6

76,9

95,0

1260

63,0

82Х

52,0

Составитель В. Муронец

ТехредМ.Гергель КорректорА. Тяско

Редактор И. Касарда

Заказ 1926/19

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4

Предлагаемый (пепсин) 66,0

Предлагае(папани) 63,00

Протеолитическая активность в Ж к нативному ферменту