Способ получения иммобилизованной уреазы

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ УРЕАЗЫ, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивания реагентом, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности и стабильности иммобилизованной уреазы, используют окисленный активированный уголь, подвергнутый модификации четыреххлористым титаном, при массовом соотношении угля и четыреххлористого титана 1:0,2-0,5. 2. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что в качестве окисленного активированного угля используют окисленный сферический карбо- «g HUT или окисленный фенолформальде-) гидный уголь. f/j

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

Л Ю

РЕСПУБЛИК (1c9 (11) 3(51) С 12 N ll/14

I ф»,;-.

1 1

ОПИСАНИЕ. ИЗОБРЕТЕНИ 1

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3413666/28-13 (22) 23.03.82 (46) 07 ° 05.84. Бюл. Р 17 (72) A .В.Богатский, Т.И.Давиденко, C.A .Андронати, Е.В,Севастьянова, В.В.Стрелко, Н.Т.Картель, С.В.Михаловский и В.Г.Мильграндт (71) физико-химический институт

AH Украинской CCP и Институт общей и неорганической химии AH Украинской

CCP (53) 577.15(088.8) (56) 1. Adams R.Е. Carr P.W.-"Analy-;.

tical chemist ry", V. 50, Р 7, 944950, 1978.

2. Патент Ctt)A Р 4204041, кл, С 07 G 7/02, 1980. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ УРЕАЗЫ, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивания реагентом, о. т л и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения удельной активности и стабильности иммобилизованной уреазы, используют окисленный активированный уголь, подвергнутый модификации четыреххлористым титаном, при массовом соотношении угля и четыреххлористого титана 1:0,2-0,5.

2. Способ по п. 1, о тлич аюшийся тем, что в качестве окисленного активированного угля используют окисленный сферический карбо-- g нит или окисленный фенолформальде-I гидный уголь °

1090715

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения имьюбилизованной уреаэы, и может найти применение в медицине (для аппарата искусственная почка }5 в аналитической промышленности (для 5 создания ферментных электродов) и при очистке сточных вод от мочевины, Известен, способ Получения иммоби. лизованной уреазы, заключающийся в связывании фермента с модифицированным -аминопропилтриэтоксисиланом

:пористым стеклом (lj .

Недостатком способа является невозможность использования препарата в медицинских целях из-за токсичнос- 5 ти, обусловленной присутствием у — аминопропилтриэтоксисилана, и способности к тромбообразованию.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому 10 положительному эффекту является способ получения иммобилиэованной уреазы, заключающийся в связывании фермента с активированным углем, подвергнутым модификации сшивающим реа- 25 гентом — карбодииьждом или солью изоксазолия (2j .

Однако прч иммобилизации по известному способу уреазы заметно снижается активность фермента, невысо- gp ка и стабильность иммобилизованной уреаэы при многоразовом использовании (т "бл, 2 и 3), Кроме того, при применении указанных углей возможно возникновение запыленности, тогда как при применении их н медицине сопоставимые по размерам с форменными элементами крови пылевые частицы должны от сут ст вовать. Недостатком является также необходимость приме.нения дорогих, дефицитных карбодиис мидов: дициклогексилкарбодиимид, дибензилкарбодиимид, 1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил) -карбодиимид, 1бен зилдиэтил амин озтил к ар бодиимид, 1-циклогексил-3- (2-морфолин оэтил) — 45 карбодиимид и соли изоксиэолия, причем некоторые из них промышленностью не выпускаются.

Целью изобретения является увеличение удельной активности и ста- 50 бильности иммобилизованной уреаэы, 1

Поставленная, цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованной уреазы, заключающемуся в связывании фермента с активированным. углем, подвергнутым моди фи кации сшивающим реагентом, используют окисленный активиронанный уголь, подвергнутый модификации четыреххлористым титаном, при соотношении угля и че- 60 тыреххлористого титана 1:0,2-0,5.

Причем в качестве окисленного акти. вированного угля используют окисленный сферический карбонит или окисленный фенолформальдегидный уголь.

Данный способ позволяет получать нерастворимую уреаэу, отличающуюся высокой активностью и стабильностью.

Особым преимуществом обладает акис. ленный сферический карбонит, отличающийся высокой химической стойкостью, малым изменением прочности в широком интервале развития пори стости, полным отсутствием пыли, при этом для окисленных сферических карбонитон прочност ь, обеспечив ающая отсутствие пыли, сохраняется вплоть до V

1,2-1, 3 см /г, повышенной адсорбционЯ ной емкостью к средним и крупным молекулам при сорбции их из водных растворов, и особенно к ионам NH,oáðàçóþщимся в процессе разложения мочевины, что способствует дополнительной стабилизации уреаэы, уменьшая концентрацию и тем самым ингибиронание

Ф фермента ионами NH4 °

Применение в качестве связывающего реагента четыреххлористого титана помимо упрощения процесса за счет применения менее дефицитного сшивающего реагента позволяет увеличить выход уреазной активности к стабильностии иммо били зон ан ного фермент а.

Весовое соотношение окисленный сферический карбонит: четыреххлористый титан можно варьировать от 1:0,2 до 1: О, 5, дальнейшее унеличение количества четыреххлористого титана (табл. 1) уменьшает активность уреазы. Это, по-видимому, связано с ухудшением адсорбционных снойстн носителя по отношению к выделяющимся в ходе реакции ионам аммония, что ингибирует иммобилизонанную уреазу.

Иммобилизонанная указанным способом уреаза при хранении при 5 С в течение 1 мес, сохраняет 80Ъ исходной активности. При использовании н реакторе периодического действия (13 раз) сохранялось 60Ъ исходной активности, рН оптимум иммобилизонан. ной уреазы 8,5, а температурный оптимум 50 С. Отмечено существенное увеличение термостабильности. При 70 С сохраняется 56Ъ исходной активности иммобилизованной уреазы, тогда как натинная н этих условиях полностью инактивируется. Стабильность препарата выше, чем при иммобилизации по известному способу (табл. 2) . При иммобилизации предлагаемым способом сохраняется 44Ъ исходной удельной активности, а связывается

ЗОЪ белка, При иммобилизации по известному способу сохранение удельной актинности уреазы значительно ниже (табл. 3) .

Пр и ме р l . 2 г окисленного сфери чес ко го к ар бонит а сус пендируют в 5 мл воды, по каплям при интенсивном перемешинании прибавляют 0,5 г четыреххлористого титана, процолжают

1090715

Таблица 1

Соотношение: угля Активность имьобилии четыреххлористо- зованной уреазы, % го титана от максимальной

Процент связывания белка (от максимального) при иммобилизации уреаэы

1:0 05

42

1-A 1 (63

1:0,2

97

1:0,3

1:0,4

1:0,5

1:0,6

100

100

100

100

100

97

1:0,7

93 перемешивание 1 ч. Носитель многократно промывают дистиллированной . водой. Аналогично получают носитель, обработанный 0,2 г четыреххлористо-. го титана. K 800 мг полученного таким образом угля добавляют раствор

10 мг уреазы в 10 мл фосфатного буфера, рН 7,6 (энзиматическая активность 34 ед/мг препарата) . 3a единицу уреазной активности принимается такое количество фермента, в результате реакции которого с субстратом выделяется 1 мкмоль аммиака за 1 мин нри 30 С. Полученную смесь перемео шивают 4 ч при. комнатной температуре. Затем методом декантации промы- 15 вают фосфатным буфером рН 7, 6 1 М раствором КС1 и дистиллированной водой. Получают препарат иммобилизованной уреазы с активностью 55,9 ед/г носителя, что соответствует 44%-му уО сохранению исходной удельной активности при 30%-ом связывании белка.

Пример 2 . 2 г окисленного фенолформальдегидного угля суспендируют в 5 мл воды, по каплям при интенсивном перемешивании прибавляют

0,5 г четыреххлористого титана, продвлжают перемешивание 1 ч. Носитель многократно промывают дистиллированной водой.

К 800 мг полученного таким образом модифицированного окисленного фенол.формальдегидного угля, добавляют раствор 10 мг уреазы в 10 мл фосфат. ного буфера рН 7,6 (экзиматическая активность 34 ед/мг препарата) .

Аналогично примеру 1 получают препарат иммобилизованной уреазы с активностью 51,3 ед/г носителя, что соответствует 40, 4%-му сохранению исходной удельной активности при

30%-ом связывании белка.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет получить стабильные препараты иммобилизованной уреаэы с более высокой удельной активностью, отличающиеся значительной термостабильностью при повышенной температуре, способные к многоразовому использованию.

Использование предлагаемых окисленных углей (окисленного сферического карбонита и окисленного фенолформальдегидного угля) позволяет исключить запыленность форменных элементов крови, что особенно важно лпя нормального функционирования аппара та искусственная почка и позволяет испольэовать иммобилизованную уреаэу в медицине.

Замена дефицитных и дорогих сшивающих реагентов на четыреххлористый титан значительно удешевляет по-. лучение целевого продукта.

1090715

Таблица 2

Потери исходной

Сшивающий реагент активности

Моча 5 л

Раствор мо- Плазма крочевины ви 5 л

1, 5Ф-ный

5 л

80

100

70.100

ФАУ©

100

100

27

20

65

l6.

ФАУ

Darco

d-60

55.

20

П р и м е ч а н и е . СКНь — окисленный сферический карбонит; ФАУр — окисленный фенолоформальдегидный уголь; Darco d-60 марка угля.

Таблица 3

Сшивающий реагент

Сохранение исходной активности, ф

Уголь

1-Циклогексил-3-(2- морфолиноэтил)карбодиимид (известный) СКН

ФАУО

Darco d-60

15

СКН

Дициклогексилкарбодиимид (известный) 10

ФАУ

13.Darco d-6О

Четыреххлористый титан (предлагаемый способ) 40,4

Составитель В. Муронец

Редактор Н.Джуган Техред Т.Маточка Корректор 0. Билак

Заказ 3015/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5. Филиал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

1-Циклогексил3-(2-морфолинозтил) карбодиимид (известный способ) Четыр еххлористый титан (предлагаемый способ) Darco

d-60

СКН

ФАУ„

Darco d"60

Диализирующая жидкость

5 л