Диагностикум для выявления антигена гепатита в

 

ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В, содержащий частицы полистирола размером 0,2-0,23 мкм с сорбированными на них специфическими антителами при концентрации последних 0,05% и солевой раствор, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума , он дополнительно содержит нормальную сьшоротку морских свинок, в качестве солевого раствора он содержит физиологический раствор при следующем количественном соотношении компонентов , мас.%: Частицы полистирола размером 0,2-0,23 мкм с сорбированными на них специфическими антителами при концентрации последних 0,05% 0,5-0,8 Нормальная сыворотка морских свинок2-5 Физиологический О) растворОстальное

СОЮЭ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) (11 А 61 К 39/42

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1

H ПАТЕНТУ

2-5 I

Остальное Q) раствор

1С-!

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 2322065/28-13 (22) 13.02.76 (31) 550949 (32) 19.02.75 (33) США (46) 07.05.84. Бюл. У 17 (72) Джордж Эдвард Лоук и Бела Золтан

Хорват (США) (71) Варнер-Ламберт Компани (США) (53) и 616-07(088.8) (56) 1. А.3. ФРГ Р 2237204, кл. G 01 N 33/16, опублик. 1975. (54)(57) ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ВЫяВления

АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В, содержащий частицы полистирола размером 0,2-0,23 мкм с сорбированными на них специфически— ми антителами при концентрации последних 0,05Х и солевой раствор, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности диагностикума, он дополнительно содержит нормальную сыворотку морских свинок, в качестве солевого раствора он содержит физиологический раствор при следующем количественном соотношении компонентов, мас.Х:

Частицы полистирола размером 0,2-0,23 мкм с сорбированными на них специфическими антителами при концентрации последних 0,057 0,5-0,8

Нормальная сыворотка морских свинок

Физиологический .

109 |8чА, Частицы полистирола размером 0,2-0,23 мкм, с сарбираванными на них специфическими антителами при концентрации последних 0,05%

Нормальная сыворотка морских свинок

Физиологический раствор

0,5-0,8

2-5

Остал ьнс е;;;

Диагностикум для выявления антиге-. на гепатита В содержит водную сусг:;ензию мелко раздробленных частиц синте--тической смолы, покрытых очищенным антителом, специфическим для повер = ностного антигена гепатита H. Эти частицы представляют собой сферические полистиралавые частицы„ и,.еющие диаметр примерно 0,23 мкм, но подхо,дят также частицы полистирола или других синтетических смол, например акриловых, имеющие одинаковые размеры 0,05-2,0 мкм. Антитела, специфиЧеские для поверхностного антигена гепатита В, предпочтительно получают от млекопитающих, например, людей, овец, коз, кроликов или морских свинок, или иэ птичьих источников, та— ких как куры или индейки, которые содержат антитела, или были иммунизированы в высшей степени очищенным поверхностным: антигеном гепатит", Б,. полученным из крови человека, аг э .

Изобретение относится к медицине и касается диагностического состава для выявления гепатита B.

Известен диагностикум для выявления антигена гепатита В, содержащий частицы полистирола с сорбированными на них специфическими антителами и солевой раствор Р1 1

Однако известный диагностикум не обладает достаточно высокой чувстви- iQ тельностью.

Целью изобретения является повышение чувствительности диагностикума.

Эта цель достигается тем,, что диагнаетикум для выявления антигена 15 гепатита В, содержащий частицы полистирола размерам 0,2-0,23 мкм с сср,бированными на них специфическими ан— тителами при концентрации последних

0,05% и солевой раствор, дополнитель-:б но содержит нормальную сыворотку морских свинок, в качестве сслевога раствора ан содержит физиологический раствор при следующем количественном са-. t, отношении компонентов,,ac,%: .э

Морских свинок или других животных, таких как кролики, козы, иммунизируют поверхностным антигеном гепатита В па известному методу, Первичная иммунизация антигеном в

:: oIiíîI вспомогательном лекарственном вешестве Ф|эеунда в подушечки лап

c"îпроваждается повторяемыми внутрибрюшинными, внутримышечными, подкожными или знутривенными прививками антигена с использованием или без использования вспомогательного лекарственного вещества. После смешивания сывороток, собранных от иммунизированных животных„ остаточное антитело цля протеинов сыворотки человека, «сли оно присутствует., удаляется пссредстьам кантактиравания антисыворогки с нормальной сьвароткой чело:века, Затем гамма-глабулин может .-:золираваться посредствам преципитации I4%-ным водным сульфатом натрия диализирсваться против буферированного фосфатом водного физиологического рас.твара псьаренной соли и, предпочо

-.Ительно,, ца 5б С в течение примерно

30 мин, .-тобы разрушить комплемент.

Далее антитела очищают па общим известным метапам. Специфические по .ерхпастные антитела гепатита В очищают от абсорбированных сывороток животного (предпочтительна сывороток

Iopcêoé свинки) посредством смешива: вЂ.:Ия этих сывороток в оптимальных прог;арциях с. сызаратками человека со, ержащими поверхностный антиген гепатита В, инкубиравания при 37 С в теение часа, à "-.àòåì в течение ночи

:-ри -. С. Образованный таким образом, О препигитат (асацак) антиген-антитела дважды промывают в холодном буфери-, ропапнам фосфатом физиологическом растворе поваренной соли, чтобы уда.г.- ть большинства остаточных неспецифических протеинов. Затем этот преципи-ат ептиген-антитела растворяют в халсдпай 0,2 М уксусной кислоте (2;î o - аха1эозь:, рН 2>3) или различных мсльпых ка: центраций хаотропических

:.:Оная, ;ап,эимер 2,0 Y. тиоцианата натрия, рН 6„6. Могут использоваться другие ссатветствующие буферные смесгн„ чтобы, вЂ,иссапииравать комплексы антигcH ан i Hòeëo Эти диссациирОван» ные антигены и антитела разделяют центрифугирсванием при 25000-28000 оборотов в минуту в течение 12-15 ч или при 30000 оборотов в минуту в

1091844 4 лятор), добавляемый после абсорбирования антитела на частицах, например инертный протеин, такой как сывороточный альбумин при концентрации, например, 0,1 вес.7,/объем.

Диагностикум также содержит нормальную сыворотку (т.е сыворотку, не содержащую ни антитело, специфическое для поверхностного антигена гепатита В, ни сам антиген), полученную от той же разновидности животных, что и та, от которой получена сыворотка, содержащая, антитела. Присутствие этой нормальной сыворотки существенно снижает процентный состав ложно положительных результатов, когда используют диагностикум для выявления поверхностного антигена гепатита В в пробах крови. Предпочтительно около одной части нормальной сыворотки содержится на 20-50 частей (по объему) водной суспензии частиц смолы, покрытых антителом.

Если нормальная сыворотка от той же разновидности животных,.что и та, от которой была получена содержащая антитела сыворотка, не содержится в диагностикуме примерно 107 сывороток человека, не содержащих поверхностного антигена гепатита В, будут агглютинировать частицы смолы. Это происходит благодаря присутствию такого рода веществ в сыворотках человека, которые реагируют с другими материалами, происходящими от антисыворотки животных, из которой получен поверхностный ачтиген гепатита В. Однако, если содержится нормальная сыворотка животного, только примерно 1-37 сывороток человека будут агглютинировать частицы смолы при отсутствии в этих сыворотках поверхностного антигена гепатита В. Это может иметь место при наличии в нормальной сыворотке животного, которые способны реагировать с этими веществами в сыворотках человека и таким образом предупреждать их от вызывания агглютинации частиц смолы. течение 4 ч на непрерывном градиенте сахарозы порядка 10-407 в зональном роторе Бекмана типа Т1-15. Ротор разгружают накачиванием в него 507 сахарозы. Чтобы смешать градиент, 20 мл фракции проверя на ультрафиолетовое поглощение в 1 см ячейке при

280 m пиковые фракции смешивают и получают очищенную фракцию специфического антитела и очищенную фракцию 10 антигена. Затем обе фракции нейтрализуют применением 0,1 í. NaOH. Фракцию антитела концентрируют до объема исходной сыворотки и диализируют в течение ночи против буферированного 15 глицином физиологического раствора поваренной соли. Затем очищенное антитело титрируют и стандартизируют.

0,17. азида натрия можно добавлять в качестве противокоагулирующего 20 средства для использования в приготовлении диагностического реагента.

Антитела разбавляют путем приготовления небольших дозировок диагностического реа ента с различными разбав- лениями антитела и испытания их с рядом сывороток человека, содержащих поверхностный антиген гепатита В.

Разбавление, дающее лучшие показатели в сравнении с этим рядом, когда оно покрывает частицы смолы, выбирают для приготовления диагностического реагента.

Разбавленные антитела смешивают с имеющими диаметр 0 2 мкм латексныЭ

35 ми зернами полистирола. После смеши- . вания в течение одного или двух часов эти зерна трижды промываются буферированным глицином физиологическим раствором поваренной соли. 4

Водная суспензия содержит пример1 но 0,5 вес.7/объем частиц смолы, но. может содержать и 0,1-3 вес.7/объем частиц смолы. Для приготовления диагностикума эта суспензия предпочти- 45 тельно содержит примерно 0,05 вес.7./

/объем антитела, абсорбированного на частицах смолы, но этот состав может меняться в соответствии с концентрацией частиц. Процентное содержание Sil антитела должно быть достаточным, чтобы предупреждать аутоагрегацию частиц резины. Для шарообразных частиц полистирола порядка 0,23 мкм в диаметре это составляет примерно у одну десятую веса частиц.

Суспензия предпочтительно содержит стабилизатор дисперсии (антикоагуОбеспечивается контроль нормальной сыворотки человека, которая получается из неразбавленной нормальной сыворотки человека; она является отрицательной в отношении поверхностного антигена гепатита В при испытании . вЂ,aòåê". ным реагентом и методом радиоактивных изотопов.

Сыворотку положительного контроля лпиготавливают и= имеющейся известной роля.

3. Сыворотка отрицательного контроля.

В. Система подтверждя1эщего к«питания.

1 . СВЯЗЯнные с гепЯтитсм Янтитс3. 11! (человека).

2. Контроль нормальной сыворотки человека (отркпательный для поверхностного антигена гепагк-. та В).

3. Реагент поглощения ревматоидного фактора.

Разбавитель подтверждающего испытания.

21) !

Связанные с гепатитом Bнтитела (человека) получают из плазмы человеЗс ка, которая содержит антитела для 11с1- - верхностного антигена гепатита В.

Эту плазму принимают из ра:зличных плазмофорезисных (плазмопригатовительных) центров, ее титрируют гепь ::0 диффузией и преобразуют в сыворст1»! путем добавления хлсрида кальция к бычьего тромбина, Зятем кз этой сы-воротки приготавливают гамма-глобулкн путем прецкпитацки l6X-íûì сульфа"-см

5»атрия. Посля прсмьсвания прецкпктгтB (осадка) в 11ч7-нсм сульфате натрия состав диализиру1от в течение :,ñåé но чи против низкой молярности фссфа гного буфера и пропускают через цеп-сo люлозу типа ДЕАЕ, уравновешенную тем же буферам. Очищенный гамма--глав булин затем стандартизируют пс концентрации и диялизируют к!рот»в буфе. рированного фосфатом физиологическо-го раствора поваренной соли.

Реагент абсорбента ревматоидногс! фактора состоит из .г1атексных -epe. -I (бусинок, шариков) „пакрытьгх нар11Я31ьположительной на поверхностный янтиген гепатита В сыворотки человека.

Эту сыворотку подвергают термообработке при 60 С в течение 10 ч, а затем дважды последовательно разбавляют в нормальной сыворо — êå человека.

Разбавление, используемое для этогс продукта, представляет собой разбавление, дающее определенную реакцию 1 латексным реагентом. ! 0

Диагностикум состоит кз следующих компонентов.

А. Система отсеивающего испытания

1. Связанные с гепатитом антитела. абсарбираванные на ла.тексных зернах (бусинках, шариках).

2. Сыворотка полсжителььаго кокт"!

»3 ным гамма-г11обулином человека. Он образуетс5: посредством приготовления

« T" гнгСартн«1 о раствора Очищенногс гамма -глобулина в буферировакном

;л !и 1ом фкэ»алогическом растворе

iIoëapB1»1ой соли с добавлением сус.;«»В»11 из 0,2 мкм полистироловых нерон к путям нагревания при 57 С течение !5 мин„ Затем эту суспензию ..3 аз ба f35IBIQT B o 5 ô«p»poHBHHOM г!IHIIHHOM

:»B vo!Io1»we: ком рав творе поваренной с оли .

Разбавктель подтверждающего испыTания г1риготавливают путем разбавления рас.твора 307-ного альбумкна оычьей сыворотки Оуферированным фосфатом физкслс-.ическсго раствора повар;.нной соли да 5Е-ной концентрации про Tе на,, .1сньсTB»1, про вод.ят следующим обPBÝOb!.

ПР11готавд»13ают пробы кровк-..

Сывороткя является предпачтктег1ьной формой прооы (образца) крови.

Если проверяемая проба представляет сосок цельную кровь, ее необходимо сначала обработать, чтобы растворить в ней клетки и поедупредить коагуляцк;о. Для этой це;1» ее обрабатывают водным ра.збывктелем, содержащим безксннсое поверхностно-активное вещество ти:.а пат!51сксиэ 1»лированного алкилЙеиолы„ например изооктилфенокси-пслиОКСИЭ I »ËÝTBI::СЛ .1 ЛИМОННО КИСЛЫЙ НЯТ окй„ .;сл» проверяемая проба представляет соосй сыворотку крови, сна должна.

oодержать а1 тикоагулянты, такие как г иман;lo-кислый наг1зкй, Прекмуществен.-1 с ее. также обрабатывают тем же самым воднь!см раз бявителем. содержащим безионное поверхностно-активное яещест".Вс> кяк к для «ельной крови, чтобы раст= 3 op5I T:ü лlобые с с. та точные кл6 тк 1л при сутс т31ующис1 в ней.

CIII.!»ô»÷1IooTü реагента определяют

:;:óTåi1 сра1знгнкя =га с целым рядом ног:аж»тель :1х и o!рицательных сывороток,: iocTBB!Iÿåìû!» Бюро Биологических наук, а тBI»;е с рядам кз 100 отрицаTà I1I) НЫХ СЬК3 DPO TО К ) СООРЯННЬ|Х ОТ Н P мяльн1,д» Во б»15oaол r Iaев, Рг; —.кцконну1о способность опредепякгг путем суспендирования данного рея ента энергичньгч перемешивянкем, для того в одно из испытательных углублений 1.я пластмассовых лабораторн>х пнасткках налива!от 3 капли сыворотки

1091844 положительного контроля. Во второе прилежащее углубление наливают 3 капли сыворотки отрицательного контроля.

К каждой пробе добавляют по одной капле реагента. Перемешивают полностью, используя отдельный миксер для каждого углубления. Вращают пластину на механическом ротаторе в течение 10 мин

"о скоростью вращения 150 оборотов в минуту. Проверяют смеси через освещаемый отраженным или рассеянным светом просмотровый прибор.

Отчетливо положительная, слабая (1 ) реакция должна наблюдаться при пробе сыворотки положительного контроля. Никакой реакции не должно наблюдаться с пробой сыворотки отрицательного контроля.

Реакционную способность сыворотки положительного контроля испытывают >О латексным реагентом, чтобы гарантировать реакционную способность порядка 1+

Сыворотку отрицательного контроля испытывают латексным реагентом, чтобы гарантировать отрицательную реакцию.

Контроль нормальной сыворотки человека.

Проверку на специфичность правадятЗО для того, чтобы убедиться, что она не реагирует с латексным реагентом и что она не подавляет положительные ,сыворотки в отношении поверхностного антигена гепатита В. 35

Связанные с гепатитом антитела (человека).

Реакционную способность проверяют путем гель-диффузионного титравания посредством использования стандарт- 40 ного поверхностного антигена гепатита В.

Испытания на специфичность проводят, чтобы определить, будет ли эта сыворотка специфически подавлять по- 4 ложительные пробы поверхностного антигена гепатита В, Реагент поглощения.

Реакционную способность определяют путем испытания реагента с сыворотка- о ми, содержащими ревматоидный фактор, чтобы гарантировать его реакцию с этим фактором и частичное поглощение его из сывороток.

Разбавитель подтверждающего испы- 5 тания.

Испытания на специфичность проводят с использованием этого разбави1теля, чтобы убедиться, что он не реагирует с латексным реагентом и что ан не подавляет положительные сывороч" ки поверхностного антигена гепатита В.

Испытание проб сыворотки (отсеивающее испытание) проводят путем отделения 120 . сыворотки в углубление на пластмассовой пластине.

Добавляют одну каплю латексного ре гента.

Полностью смешивают, используя отдельный находящийся в пользовании миксер для каждой пробь, (образца).

Вращают пластину на механическом роторе в течение 10 мин со скоростью

150 оборотов в минуту.

Проверяют смеси через совмещаемый отраженным или рассеянным светом просмотровый прибор.

Реакции подсчитывают по баллам на шкале ат 11 до 4", соответствующей увеличению интенсивности агглютинации.

Подтверждающая процедура нейтрализации.

Помечают одну пробирку объемом

10 х 75 мм идентификационным номером пробы и индексом "А". Помечают втору-о пробирку идентификационным номером пробы и индексом "В".

Добавляют две капли (примерно

80 ) связанного с гепатитом антитела (человека) в пробирку, снабженной индексам "А".

Добавляют две капли нормальной сыворотки человека отрицательного контроля в пробирку, снабженную индексом "В

Добавляют 240+0 èñïûòàòåëüíîé пробы в каждую из пробирок, отмеченных индексами "А" и "В".

Перемешивают содержимое этих пробирок и подвергают инкубации в течео ние 30 мин при 37 С в водяной ванне.

Испытывают 120+ из пробирок "А" и "В", используя атсеивающие реагенты и процедуры. Для большинства относительно мало титрованных положительных проб дифференциация между специфическими и неспецифическими положительными результатами может быть без дальнейшего испытания, поскольку проба А нереагирующая, в то время, как проба "В" остает ся положительной, показывая специфическое подавление антителом человека. Для тех образцов, которые являются специфическими, но

1 С!п1 844 более сильно титрованными, а также для тех, которые являются неспецифическими, требуется дальнейшее испытание.

Для каждой пробирки, требующей 5 дальнейшего испытания, помечают дополнительные шесть пробирок с разбавлениями от 1 : 4 да : 128, а также идентификационным номером пробы и индексами "А" или "В". 1О

Добавляют 200 разбавителя подтверждающего испытания в каждую,робирку, включая пробирки, которые содержат пробу пациента и антисываротку человека или нормальную сыворотку "5 человека, т.е. исходные пробирки "А и "В", делая разбавление в них примерно 1 : 2.

Дважды разбавляют перекосом 200рР, используя отдельные микрапипетки для ?О каждой пробирки и хорошо перемешивают перед удалением проб.

Испытывают 120р.0 из каждой пробирки, используя отсеивающие реагe.гты и процедуры.

Титр, полученный в ряду- "В" (проба и нормальная сыворотка человека). должен быть в четыре раза (две пробирки) вьппе, чем в ряду "А" (проба и нейтрализующее гепатит связанное Ю антитела (человека) для того, чтобы рассматривать пробу (образец) в качестве специфического позитива поверхностного антигена гепатита В.

В случае, когда, как титр А", так и титр "В" является выше, чем i:128, разбавление должно производиться далее до тех пор, пока не будет определена конечная точка.

Поскольку целый ряд проб„. содержа-" щих ревматоидный фактор, реагирует с латексным реагентам, необходимо диф-ференцировать пробы, содержащие как поверхностный анткген гепатита В., та.— ;;

/1 > и ревматаидный фактор.

Присутствие ревматоидного фактора можно определить испытанием сыворотки реагентом поглощения ревматоидного фактора (латекс, покрытый гамма †глас,б булином человека) путем смешивания

120 мл пробы и одной капли поглощающего реагента на пластмассовом слайде и вращения в течение пяти минут., Если проба содержит ревматоидный фактор, она может поглощаться посред-- ствам добавления 720р.(пробы в лробирку 10 х 75 и добавления шести капель поглощающего агента в эту пробирку,. Хароп>а перемешать и инкубировать прк .<аь!ватной темгерагуре

I> еч е и:.! е >>ят:-! минут . ВыпОлнить под твержпающую процедуру нейтрализации на абсopo«poaoí!oé проСе.

Приготовление очищеннага антитела ло>зерхна< тному антигену гепатита В. . 1орских свинок иммунизируют поверхностным àнтигенам гепатита В, очи>шенньп> известным способом.

Первичная иммунизация антигенам в полном вспомогательном лекарственном веществе Фреунда в подушечки лап морских свинок сопровождается двумя внутрибрюшинными прививками этого ан- игена без >зспоыагательного лекарственного вещества. После объединения сывороток, собранных от иммунизированных животных, остаточный протеин, если это необходимо, удаляют посредством контактирования антисыворотки с нормальной сывороткой человека.

Гамма-г >обулин затем очищают посредством преципитации с 14! вес.%/oáúåì водным сульфатам натрия, диализируют против буферираваннаго водным фосфатом физиологического раствора позарен>>ой соли и предпочтительно о, нагревают прк 56 С в течение примерlo 30 M-.III, чтобы разру>пить комплемент.

Очищенную сыворотку смешивают с сьгвароткой человека, содержащей поверхностный антиген гепатита В, а подвергают инкубацкк при 4 С. Полученный таким образом приципитаг антиген-антитела затем дважды промывают в холодном буферираванном фосфап ам физиологическом растворе пава— ренной <=оли, чтобьь удалить большинство ос!;.точных неспецифических протеинов. Затем этот преципитат антиген-антитела растворяют в холодной 0,2 11 уксусной кислоте (2% сахарозы, рН 2,3 или хаотропическкх. ионов), ь

Зти дис< оциироганные антигены к антитела разделяют центрифугированкем при

25000-28000 оборотах в минуту в течение 12- :" ч, или при 30000 оборотах в минуту в течение 4 ч на непрерывном 10-40%-.ном градиенте сахаразы в зональном роторе Бекмана типа Т1 — 15.

Ротор р !çãpóæ !>aò посредством нагнетания 50% сахарозы в нега, чтобы смешать градиен", а 20 мл фракции проверяют

>ra ультрафиолетовое логлощенке в 1 см ячейки лри 280 мл, а пиковые фракции объединяют„ чтобы дават>- очищенную, 1091844

12 специфическую фракцию антитела, которую затем нейтрализуют 0,1 í. NaOH.

Фракцию антитела концентрируют до исходного объема сыворотки и диализируют в течение ночи против буфериро- 5 ванного глицином физиологического раствора поваренной соли. Затем очищенные антитела титруют и стандартизируют, Эти антитела оптимально разбавляют путем приготовления малых дозировок диагностикума с различными разбавлениями антитела и испытания их против целого ряда сывороток челове— ка, относительно которых известно, что они содержат поверхностный антиген гепатита В. Разбавление, дающее наилучшее показание против этого ряда, когда нанесено на частицы смолы, выбирают для приготовления диагности кума.

Диагностикум готовят следующим образом.

Пример 1. 30 вес.%/объем водной суспензии 0,23 мкм полистироловых шариков разбавляют до 8 вес.7/

/объем буферированным глицином физиологическим раствором поваренной соли и диализируют против буферирован30 ного глицином физиологического раствора поваренной соли в течение всей ночи, Затем ее немедленно добавляют к 9 объемам очищенной антисыворотки морских свинок,,содержащей антитела поверхностному антигену гепатита В (разбавленному до 0,05 вес. /объем) и постоянно перемешивают в течение

30 мин. После этого добавляют один объем альбумина бычьей сыворотки (i вес.7/объем) и затем — азид нат- 4б рия, чтобы концентрация была порядка 0,1 вес.7/объем в окончательном продукте.

Пример 2. 30 вес.7/объем еуспензии полистироловых шариков

45 (0,05-2,0 мкм) разбавляют до

8 вес. /oáúåì буферированным глицином физиологическим раствором поваренной соли и стерилизуют посредством добавления раствора гипохлори- о та, Затем диализируют против буферированного глицином физиологического раствора поваренной соли, чтобы удалить гипохлорит. Затем этот состав добавляют к 9 объемам с соответству- 5 ющим образом разбавленной, очищенной сыворотки морских свинок — антителам поверхностного антигена гепатита В.

Полистироловую суспензию добавляют медленно с перемешиванием, которое продолжается в течение одного часа.

Полистироловые шарики центрифугируют, дважды промывают на центрифуге буферированным физиологическим раствором поваренной соли и снова суспендируют в исходный объем в буферированном физиологическом растворе поваренной соли. Альбумин бычьей сыворотки добавляют с перемешиванием в течение

30 мин. Одну десятую объема разбавленной нормальной сыворотки от неиммунизированных морских свинок (разбавленной 1:3,5 буферированным глицином физиологическим раствором поваренной соли) добавляют к этому составу и смесь снова перемешивают в течение 30 мин, и, наконец, эту смесь энергично встряхивают, чтобы диспергировать любые агломерации частиц.

Все растворы, которые использовались, стерилизуют посредством фильтрации и содержат в себе 0,1 вес.%/объем азида натрия в качестве стабилизатора дисперсии (антикоагулятора).

Пример 3. Сыворотку положительного контроля готовят из целого ряда известных в качестве положительных на поверхностный антиген гепатита В сывороток человека. Эту сыворотку подвергают тепловой обработке при 60 С в течение примерно 10 ч, а затем дважды последовательн9. разбавляют в нормальной сыворотке человека. Используемое разбавление является таким, которое дает (1-4) реакцию с латексным реагентом по примерам 1 и 2. Затем этот состав стерильно фильтруют и помещают в стерильные контейнеры.

Пример 4. Сыворотку отрицательного контроля получают из неразбавленной сыворотки человека, которая показала себя отрицательной в отношении поверхностного антигена гепатита В при использовании латексного реагента по примеру 1 или примеру 2 в применении метода радиоактивных .изотопов. Состав стерильно фильтруют и помещают в стерильные контейнеры.

Пример 5. Плазму человека, которая содержит антитела поверхностному антигену гепатита В, титруют гельдиффузией и преобразуют в сыворотку посредством добавления хлорида кальция и бычьего тромбина. Гамма-глобу10918чч

Составитель „ Смирнова

Редактор С. Тимохина ТехредЖ,К,:стелевич

Корректор С. ШекмаР

Заказ 3104/56 Тираж 688

ВНИИПИ Государственного комит=та СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. д. - /5

:1одписное

Филиал ПГ(П "Патент",, г. Ужгород,, ул. Проектная. А лин затем приготавливают из этой сыворотки посредством преципитации с 16 вес.7./объем сульфатом натрия.

После промывания этого преципитата в 14 вес.7/объем сульфата натрия его диализируют против фосфатного буфера низкой молярности и пропускают через целлюлозу типа:IEAE, которая была ранее уравновешена тем же самым буфером. Очищенный гамма-глобулин затем стандартизируют и диализируют против буферированного фосфатом фи-зиологического раствора поваренной соли. Затем этот состав стерильно фильтруют и помещают в стерильные 15 контейнеры.

Hp и м е р 6. Стандартный раствор очищенного гамма-глобулина чело-века в буферированном глицином физиологическом растворе поваренной солн 2Î добавляют к суспензии 0,2 мкм поли-стирольного латекса и нагревают при

57оС в течение 15 мин. Суспензию, используемую для абсорбирования ревматоидного фактора в испытываемых сы-- 2 воротках, разбавляют в буферированном глицином физиологическом растворе :оваренной соли и помещают в стерильные контейнеры.

Пример 7. Разбавитель под-- зо тверждающего испытания приготавливают посредством разбавления раствора

30 вес.X/oáúåì раствора альбумина бычьей сыворотки в буферированном фосфатом физиологическом растворе поваренной соли до 5/-ной концентрации протеина. Этот раствор затем стерильно фильтруют и помещают в стерильные контейнеры.

П р и и е р 8. Относительно концентрации очищенных антител морских свинок; объем суспензии полистирола смешан с таким объемом очищенной антисьпзоротки морских свинок, что получаемая в результате суспензия будет иметь концентрацию антител. равную 0,05 процента в/в, т.е. проp,óêò содержит около 0,8 процента в/в сфер полистирола и примерно 0 05 про/ цента в/ в антител по отношению к поверхностному антигену гепатита В.

П р и и е р 9. Аналогично примеру 1 продукт содержит 0,8 процента сфер полистирола. Кроме того, îí содержит одну десятую объема (10 процентов в/в,) разбавленной в отношении

1:3„5 нормальной сыворотки морских

:iâHïîê. Разбавленная в отношении

T.-3,5 сыворотка соответствует раство«у который содержит примерно 30 процентов в/в сыворотки. Соответственно, конечный продукт содержит около 3 процентов в/в нормальной сыворотки мор..ких свинок.

Предла; асмый диагностикум обладает высокой чувсгвительностью для выявле.ыя антигона гег:атита В за счет того, .-п о используют высоко очищенные антитела и нормальную сыворотку тои же разновидности животньгх, от которых были получены сг,ецифические антитела, что позволяет снизить число ложно положительных результатов.