Способ определения повреждения микроорганизмов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ при внешних воздействиях по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа , определяют степень электроориентации образцов интактных и полностью поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной суспензии при частоте электрического поля соответственно

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

Я-Я

04= .300 „) (o

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3480628/28-13 (22) 05.08.82 (46) 07.06.84. Бюл. Р 21 (72) В.М.Фомченков, В.А.Чугунов, А.К.Ажермачев и П.В.Бабаева (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (53) 576.8.095(088,8) (56) 1. Мейнелл Дж,, Мейнелл Э.

Экспериментальная микробиология.

N. "Мир", 1967, 12, 28.

2. Дегтярева Т.В. и др. Поведение клеток хлореллы в неоднородном переменном электрическом поле,-B кн.:

Управляемый биосинтез и биофизика популяций. Красноярск, 1969, 68.

3. Авторское свидетельство СССР

9 446699774488, кл. С 12 M 1/34, 1973, (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕжДЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ при внешних воздействиях по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа, определяют степень электроориентации образцов интактных и полностью поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной су3(51) С 12 Я 1 02 С 12 hl 13/00 1 00 спензии при частоте электрического поля соответственно(5 10 †5 °1) и (1 10 -1"10 ) Гц, вычисляют отношение

5 „7 степеней электроориентации для каждого образца на этих частотах, а повреждение микроорганизмов в исследуемом образце оценивают по соотношению поврежденных и неповрежденных микроорганизмов согласно формуле где и . — процент неповрежденных клеток микроорганизмов в исследуемом образце, отношение степени электро- Я ориентации клеток микроорганизмов в исследуемом образце в электрическом поле указанных частот, Г— то же, для клеток интактных микроорганизмов; — то же,для клеток полностью поврежденных микроорганизмов, причем определение степени ориентации клеток ведут при рН 4,5-7,5, удельной электропроводности суспензии микроорганизмов (10 — 10,Ом ° ;:

-4 . -г1 и напряженности электрического поля (2-15) 10 В/м.

1096280

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе и микробиологической промышленности для определения действия на микроорганизмы.повреждающих факторов.

Известен способ определения микроорганизмов, способных к размножению, после воздействия на них повреждающих факторов путем их пос;ева на питательный агар и подсчета выросших колоний (1) .

Недостатками известного способа являются большая длительность (от

1 до 14 сут), связанная с тем, что скорость роста микроорганизмов на агаре невелика и для образования заметной колонии требуется значительное время. Кроме того, этот способ имеет недостаточную точность (погрешность изменений до ЗОЪ, что обус-Я) ловлено неустранимыми погрешностями при разведении исходного препарата и распределении посевного материала на питательном агаре.

Наиболее близким по, технической сущности к предложенному является способ определения повреждения клеток хлореллы при воздействии на них понреждающих факторов по степени электроориентации при помещении суспензии клеток в переменное электрическое поле °

Согласно этому способу клетки помещают н переменное электрическое поле и наблюдают с помощью микроскопа за их поведением в поле. Понреждение микроорганизмов определяют по степени электроориентации, т.е. по потере ими способности образовь|вать цепочки вдоль cèëîíûõ линий поля и по смещению частотных границ, на которых наблюдается вращение клеток вблизи электродов (2) .

Наиболее существенными недостатками этого способа являются отсутствие количественной оценки процен- 45 та поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце и наличие субъективной ошибки вследствие визуального определения повреждения клеток. 5» 1

Цель изобретения — понышение точности анализа, т.е. определение поврежденных микроорганизмов в анализируемом образце.

Указанная цель достигается способом определения повреждения микроорганизмов при внешних воздействиях по степени электроориентации клеток при помещении клеточной суспензии в переменное электрическое поле, причем определяют степень электроориентации образцов интактных и полностью поврежденных микроорганизмов и исследуемого образца по изменению оптической плотности клеточной су- 65 спензии при частоте электрического поля (5 10 — 5 10 ) и (1 10 -1 10 ) Гц, вычисляют отношение степеней электроориентации для каждого образца на этих частотах, а повреждение микроорганизмов в исследуемом образце оценивают по соотношению поврежденных и неповрежденных микроорганизмон согласно формуле

5- Р— 100 /о, O Pl где а — процент неповрежденных клеток микроорганизмов н исследуемом образце;

/5 — отношение степени электроориентации клеток микроорганизмов в исследуемом образце в электрическом поле указанных частот; то же, для клеток интактных микроорганизмов» то же,для клеток полностью поврежденных микроорганизмов, причем определение степени ориентации клеток ведут при рН 4,5-7,5, удельной электропроводности суспензии микроорганизмов (10 -10 ) Ом м и напряженности электрического поля (?-15) 10 В/м.

На фиг.1 дана частотная зависимость степени электроориентации клеток Pseudomonas aeruginosa, инкубиронанных при разных температурах в течение 15 мин: 1-25 2-44 3-61 С

-4

I Г

6--8 10 Ом м» на фиг.2 — то же, клеток Eschex.ichia cori, инкубированных при различных температурах в течение 1.5 мин: 1-37, 2-49, 3-55 С, 6=10 Ом м ", рН 4,5; 3 — то же, рН 7,5; на фиг.4 — то же, при разной злектропроводности суспензии, О" Г : 1-10 4 2. 3 .10 4 4,10-3

1,,7 10, pH 6,5; на фиг.5 — зависимость степени электроориентации от напряжения на эдектродах ячейки для бактериальных клеток Вас131ия Ьиг1пgiensis (1) и Pseudomonas aeruglnosa (2) при частоте электрического поля 105 Гц,,электропронодности суспензии 10 Ом1M "v pH 5,5 На дп схема устройства, реализующего предлагаемый способ; на фиг.7 — частотная зависимость степени электроориентации клеток Escherichia со2i, инкубированных при различных температурах н течение 15 мин;1-37, 2-47, 3--53, 4-61 С, рН 6, 4 =10 Ом м «», на фиг.8 — то же,, клеток Escherichia

co. li интактных (1) и подвергнутых однократному (2} и четырехкратному (3) замораживаник -оттаиванию,рН 6,5, 6 =2 10 Ом м ; на Фиг, 9 — то

1 же, клеток Eschenichia со i интактных (1) и обработанных О, 5%-ой (2)

1%-ой (3} и 3%-ой (4) эмульсией

1096280 толуола (время обработки 20 мин), рН 6,5,6 =2 10 Ом "м" ; на фиг.10 то же, клеток Escherichia cori интактных (1) и обработанных 20%-м (2) и 30%-и (3) раствором этанола (время обработки 20 мин), рН 6,5, 6=2 10 Ом м .

Согласно представленным графикам достаточно достоверное определение степени электроориентации клеток возможно при указанных параметрах 1О электрического поля, так как именно в этих условиях имеют место характер. ные изменения кривых частотной зависимости степени электроориентации, что и позволяет использовать отноше- 15 ние эффектов, регистрируемых в поле мегагерцевой и килогерцевой частот, для количественной оценки числа поврежденных клеток (по расчетной формуле) . При укаэанных напряженности электрического поля,рН и удельной электропроводности суспензионной среды это отношение имеет максимальную величину для интактных клеток, что также повышает точность измере- 75 ний, Измерения проводят при напряжении на измерительной ячейке, соответству. ющем линейному участку ее амплитудной характеристики, 30

Определение килогерцевого и мегагерцевого диапазона частот.

Килогерцевый диапазон частот включает частоты от 4.10 до 4 10 Гц, а мегагерцевый от 10 до 10 Гц.

Указанные пределы определяются тем, что у клеток разных видов область минимума (в килогерцевом диапазоне) и максимума(в мегагерцевом диапазоне) частотной зависимости степени электроориентации несколько отлича- 4О ется (фиг. 1 и 2), а также тем, что в области максимума и минимума допустима регистрация эффекта на частотах, где имеет место 10%-ое изменение эффекта по отношению к 45 экстремальной величине.

Диапазон рН исследуемой суспензии определен в пРеделах 4,5-7,5, так как в этом случае обеспечиваются наилучшие условия регистрации повреждения клеток, особенно при низких рН (фиг.2 и 3), а также потому, что в этом диапазоне бактериальные клетки наименее подвержены слипанию, ухудшающему наблюдение эффекта электроориентации. Соответствующими измерениями установлено, что s случае

Escherichia cori наблюдают слипание клеток при pH c 4,0 и pH r 7,5.

Диапазон удельной электропровод- 60 ности исследуемой суспензии определен в пределах от 10 до 10 Ом м,,так как при этих значениях обеспечиt вается наиболее надежная регистрация килогерцевого минимума и мегаI .герцевого максимума частотйой зависимости степени электроориентации (фиг.4) . Увеличение электропровод ности свыше 10 Ом м нежелательно в связи с ростом мешающих факторов (разогревание суспензии, тепловая конвекция), снижающих точность измерения степени электроориентации.

Диапазон напряженности электрического поля определен в пределах от 2 103 (U =б B) до 15 10 B/м (U =

45 В, так как он соответствует максимальному изменению эффекта электроориентации в зависимости от напряжения на электродах ячейки (фиг.5), а именно эта область значений напряжений позволяет наиболее точно выявить и зарегистрировать килогерцевый минимум и мегагерцевый максимум частотной зависимости степени электроориентации клеток, что в конечном счете обеспечивает достаточно высокую точность при определении повреждения кле ок согласно изобретению.

Из фиг.5 видно, что область допустимых значений напряжения (заштрихованная) для более крупных кле ток (кривая 1) лежит при меньших, ja в случае более мелких клеток (кривая 2) при больших значениях напряжения на электродах ячейки.(и, следовательно, напряженности поля в суспензии), Пример 1. Исследуют тепловое повреждение грамотрицательных бактерий Escherichia cori НВ-110,0, Клетки инкубируют при температуре от 37 до 61 С в течение 15 мин.

Измерения электроориентации по пред лагаемому способу можно проводить в средах с удельной электропроводностью от 10 " Ом м и ниже и при рН 4-12. Однако опыты показали, что повреждения клеток выявляются лучше, если параметры суспензии выбирают следующими: удельная электропроводность 10 Ом м и ниже, рН 7,5 и ниже. Поэтому параметры суспензии следующие; удельная электропроводность 2 10 Ом "м ", рН 6,0.

Степень электроориентаиии микроорганизмов определяют на известном устройстве для контроля физиологического состояния клеток (3) .

На фиг.б изображена блок-схема устройства, котоРое состоит из источника 1 света, измерительной ячейки 2 с Решетчатыми электродами 3 и 4 и окнами 5 из оптического стекла, фотоэлемента б, самопишущего потенциометра 7, генератора 8 переменного напряжения и вольтметра 9.

Устройство работает следующим образом.

Световой поток от источника 1, пройдя диэлектрофоретическую ячейку

1096280

ОC

p< o! Ъ

1,36

100 4

80+3

74 3

2 3 ?

37

1,29

1,27

1 09

,55

1,01

Таблица1

Темпуратура, С

Таблица 3 (o

T,оС

100+ 3

1,24

75+ 3

54+ 3

1,18

1,13

47

100 3

1,02

8313

2514

1,00

1,06. 0,93

25+ 3

4+1

1,01

0,90

1,00

2, фотоэлементом 6 преобразуется в электрический сигнал, регистрируемый самописцем 7. Неоднородное электрическое поле создается в заполняющей ячейку клеточной суспензии с помощью решетчатых электродов 3 и 4.

При включении генератора 8 клетки ориентируются вдоль силовых линий поля и самописец регистрирует резкое изменение проходящего через ячейку светового потока. Величина этого изменения характеризует степень электроориентации клеток. Меняя частоту генератора 8 при постоянном напряжении на электродах ячейки

2, получают степень ориентации кле- 15 ток на разных частотах. Как показывают опыты, величина Р для неповрежденных клеток значительно уменьшается, если выбрать напряжение на ячейке соответствующим области насыще- 20 ния эффекта электроориентации по амплитудной .характеристике ячейки.

При этом точность измерений значительно уменьшается. В связи с вышеизложенным величину напряжения на 25 электродах ячейки выбирают равной

20 В, так как для клеток кишечной палочки насыщение эффекта электроориентации наступает при напряжении свыше 35 В и напряжение 10-20 В соот-З0 ветствует линейному участку амплитудной характеристики.

Определяют степень электроориентации клеток в поле мегагерцевой (4 10о Гц) и килогерцевой (104 Гц) частот и отношение степени электроориентации на этих частотах для суспензии интактных (37 С), полностью поврежденных {61 C) клеток, а также клеток иэ суспензий, инкубировавшихся при промежуточных температурах.

По выражению 1) рассчитывают про- цент неповрежденных микроорганизмов в анализируемых образцах.

Полученные данные приведены в табл. 1.

Результаты определения повреждения микроорганиз- 50 мов, Ъ

Из табл. 1 видно, что с увеличением температуры инкубации величины

Р и ct уменьшаются, что связано с увеличением числа поврежденных клеток.

Пример 2, Исследуют тепловое повреждение грамположительных бактерий Bacillus thuringiensis шт.26. Клетки инкубируют при температуре от 26 до 55оC в течение

20 мин. Удельная электропроводность суспензии 2 10 Ом 1 м, pH 6,0. Напряжение на электродах ячейки 15 В.

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1.

Результаты приведены в табл.2.

Т а б л и ц а 2

Из табл.2 видно, что и в этом случае с увеличением температуры величины Р и уменьшаются, что свидетельствует о повреждении клеток при нагревании.

Пример 3. Исследуют тепловое повреждение грамотрицательных бактерий Pseudomonas acruginosa.

Клетки инкубируют при температУре от 37 до 61о С в. течение 20 мин.

Удвльная электропроводность суспензии 10 Ом 1 м, рН 6,0. Напряжение на электродах ячейки 15 В.

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогичны примеру 1.

Результаты представлены в табл.3.

1096280

И в этом примере повреждение кле ток при нагревании приводит к умень шению 3 и сс .

Использование предложенного способа определения повреждения микро- 5 организмов обеспечивает в сравнении с известным количественную оценку числа жизнеспособных клеток, а значит, увеличение точности ана .лиза.

Следует также отметить, что при анализе бактериальных клеток небольшого размера (менее 10 м) применение известного способа невозможно в связи с тем, что размеры таких клеток находятся на пределе разрешения светового микроскопа и визуальный анализ их поведения в поле невозможен. Предложенный способ при) меним для анализа и таких мелких клеток. !

1096280

109б28ц

1096280 ча

f00

1096280

Фиг. 5

1096280

1096280

1096280

3744/18 Тираж 522 Подиисное

ВНИИПИ Государственнога комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель О.- кородумова

Редактор Т.Портная Техред С.Пегева корректор А.Тяско