Способ получения антисыворотки к катехоламину

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К КАТЕХОЛАМИНУ путем иммунизаДии животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, с последукяцим забором крови и выделением из нее антисыворотки, отличаю щ и и с я тем, что, с целью повьппения специфичности целевого продукта, в качестве антигена истюльзуют остаток катехоламина, ковалентно связанньй с белком-носителем по следующей формуле Н Н - I - Б . К - ( (снр, N N Н I N где К - остаток катехоламина, содержавший первичную аминогруппу; Н - I Б - остаток антигенного белN ка-носителя . (СН) - алифатическая цепочкаi 2. Способ по п. 1,отличаю (Л щ и и с я тем, что в качестве белканосителя используют сывороточный G: альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцйанин улитки.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„.SU„„10 7337

3(51) А 61 К. 37/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ рот ц1 3%((Я

Н

i — остаток катехоламина, N содержащий первичную аминогруппу; где КГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3510479/28-13 (22) 09.11.82 (46) 15.06.84. Бюл. Р 22 (72) С.П.Смотров, П.М.Аширов, И.Г.Шанявский и Д.Б.Сапрыгин (71) Тащкикский государственный университет им. В.И.Ленина (53) 615.373.3(088.8) (56) 1. Патент ФРГ Ф 2.608.096, кл. С 07 G 7/00.

2. Патент США Ф 3.704.282, кл. С 07 С 7/00. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИСЫВОРОТКИ К КАТЕХОЛАИИНУ путем иммунизации животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, с последующим забором крови и выделением из нее антисыворотки, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повьппения специфичности целевого продукта, в качестве антигена используют остаток катехоломина, ковалентно связан- ный с белком-носителем по следующей формуле

Н Н

К1-(СН)1Б

2 5 1

N . N

Н

1 — Б — остаток антигенного белN ка-носителя. .(СН ). — алифатическая цепочка„ .

2. Способно п. 1, отличаюшийся тем, что в качестве белканосителя используют сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или гемоцианин улитки.

1097337

10

1

Изобретение относится к иммунохимии, в частности к способаи получения антител к катехоламинам, и может быть использовано в медицине, диагностической и исследовательской работе.

Известен способ получения антисыворотки к катехоламину;путем иммуни-. зации животного антигеном, представлякнцим собой катехоламин, фенильное ядро которого ковалентно связано с полипептидом или протеином (13.

Недостатками данного способа являются низкие специфичность и сродство получаемых антител к катехоламину.

Известен также способ получения антисыворотки к катехоламину путем иммунизации животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, прн этом аминогруппа катехоламина ковалентно связана с карбоксильной группой белка или полипептида (23.

Однако известный способ позволяет получить антитела к катехоламину, обладающие низкими специфичностью и сродством, поскольку в используемом для иимунизации конъюгированном антигене остаток катехоламина близко расположен к антигенным детерминантам белка или полипептида, взятых в качестве носителя целевого антигена.

Целью изобретения является повышение специфичности целевого продукта.

Цель достигается теи, что согласно способу к катехолаиину путем иммунизации животного антигеном, ковалентно связанным с носителем, с последующим забором крови и выделением из нее антисыворотки, в качестве интигена используют остаток катехолаиина, ковалентно связанный с белком-носителем по следующей формуле

Н Н

К-1-.(СН) — I -Б

2 У

N N

Н где К вЂ” I — остаток катехоламина, соВ держащий первичную аминогруппу;

Н

1 - Б - остаток антигенного бел0 ка-носителя. (CH ) — алифатическая цепочками

В качестве белка-носителя используют сывороточный альбуиин, бычий тиреоглобулин или гемоцианин улитки.

Пример. Синтез конъюгата осуществляют с помощы сочетающего реагента — глутарового альдегида.

В качестве антигенных носителей используют бычий сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин и гемоцианин улит ки. В 5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 растворяют 5 мМ катехоламина, например норадреналина, дофамина, дофа или норметанефрина, в 0,001 мМ белка-носителя. В этому раствору прибавляют при постоянном перемешивании по капляи 2 мл 0,05 М раствора глутарового альдегида. Па истечении 30 мин инкубацни при комнатной температуре добавляют 0,2 мл 0,2 М раствора глу.тарового альдегида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч, затем к ней. приливают 0,2 ил 1Х-ного раствора боргидрида натрия и оставляют при комнатной температуре 1 ч. Далее раствор диализуют против физиологического раствора 24 ч при 4 С. Содержание связанного катехоламина в конъюгатах оценивают радиационным методом с применением .меченого тритием катехолаиина и спектрофотометрическим методом.

Иммунизацию кроликов проводят по следующей схеме: первую инъекцию (О, 1 ил смеси равных объемов полного адъюванта Фрейнда и раствора антигена с концентрацией 1 иг/мл) делают

35 в лимфатический узел бедра задней лапы. Через 3 недели 0,5 мл смеси вводят внутрикожно во множество точек в область шеи. Затем через 2 недели инъецируют смесь с неполным

4О адъювантом Фрейнда (1 мл) внутримышечно в бедро задней лапы. Последующие инъекции (0,5 ил смеси с неполным адъювантом) проводят внутрикожно с месячным интервалом. Через 7 дней

45 после введения антигена производят забор крови. Полученную антисыворотку инактивируют нагреванием при 56 С

30 мин, разделяют на аликвоты и хра» нят при -20 С.

Антитела к катехоламину идентифицируют иетодаии встречной двухмерной диффузии и по связыванию сыворотками радиоактивного катехоламина по способу, согласно котороиу к 50 мкл сыворотки в 0,1 мл 0,1 М трис-буфера рН 7,5 добавляют 3,4 нг меченого тритием катехоламина и инкубируют ари

4 С 3 ч. Радиационную смесь разделяют на колонке с сефадексом С -25, о

3 1097 применяя в качестве элюента 0,1 М трис-буфер рН 7,5. Фракции (по 1 мл) смешивают с 10 мл сцинтилляционного раствора Брея и измеряют радиактивнОсть В жидкОстнОм сцинтиляционном спектрометре. Контролем служит сыворотка интактного кролика.

Титры антител определяют путем инкубации фиксированного количества меченого тритием катехоламина с серн= 1р ей двухкратных разведений антисыворотки.Для разведения применяют 0,02 М фосфатный буфер рН 7,4, содержащий

2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. 15

Методика определения титров, специфичности и сродства антител следующая ii

К 100 мкл антисыворотки соответствующего разведения добавляют 20

0,34 нг меченого тритием катехолаиина в 0,1 мл 0,2 М фосфатного буфера рН 7,4 и 0,3 мл 0,5 Х-ного раствора бычьего сывороточного альбумнна, содержащего 0,9Х хлористого натрия..: и 0,05 Х кроличьего гаммаглобулина.

Смесь перемешивают и инкубируют 12 ч при 4 С. Связанный меченый трнтием катехоламин осаждают добавлением

0,5 мл ЗОХ-ного раствора полиэтиленглйколя и удаляют центрифугированием при 3000 об/мин 40 мин.. К 0,2 мл надосадочной жидкости добавляют 10 мл раствора Брея и просчитывают на сцинтнлляционном счетчике. Иаксималь35 ное разведение антйсыворотки, при котором связывание меченого тритием катехоламина составляет 15Х, прини- ° мают за титр антител к катехоламину.

Для Оценки перекрестнОЙ реактив 4б ности антител используют известный прием ингибирования связывания антисывороткой меченого гаптена его родственными соединениями. Специфичность антисыворотки оценивают путем добавления аналогов, например, к норадреналину, таких как дофамин, дофа и норметанефрин.

337 4

Определение связывающей способности антител проводят методом сатурационного анализа, Для количественной оценки процесса взаимодействия антител с катехоламином используют значения констант ассоциации (Касс, М ), вычисление которых производят исходя из графика

Скзтчарда.

Результаты исследования обрабатывают методом вариационной статистики по Стьюденту-Фишеру.

Положительные качества получаемых предлагаемым способом антител к кате-. .холамнну представлены в табл. У 1.

Перекрестная реактивность, которая характеризует специфичность антител, получаемых предлагаемым способом, ни.же, чем перекрестная реактивность антител, получаемых по прототипу.

Это говорит о том, что специфичность

:антител, получаемых предлагаемым спо, собом, выше. Поскольку константы ассоциации антител, получаемых предла-. гаемым способом, выше, чем констан- ты ассоциации антител, получаемых по прототипу, то можно утверждать, .что сродство антител, получаеьых предлагаемым способом, вью.

Были получены характеристики связывания катехоламина с антигенным носителем, которые сведены в табл.

;0 2 на примере норадреналина.

В табл. 3 представлены титры антител в полученных антисыворотках.

Из табл. В 3 видно, что титры антител в антисыворотках, получен ных предлагаем4м способом, выше тит-. ров антител в антисыворотках, полученных по прототипу. Для сравнения использованы антисыворотки, полученные по прототипу.

- Таким образом, специфичность целевого продукта возросла в 3-4 раза .по. сравнению с известная, что позволяет повысить чувствительность определения сенсибилизации организма к препаратам катехоламина.

1097337

Т блица1. йз

6:аю яка

Касс, М

Перекрестная реактивность, Х

НА ДА ДОФА НМН

Прим .няемый коньюгирован ный антиген

Лнтигены к

1, 12+0, 10 "10

По предлагаемому способу

100 < 0,1 3,2 <0,1

100 <О 1 2 7 <081

ГУ-HA

6, 18+0, 19 ° 10

4921 0908 10

2,49 0,12 10

БТ-НА

БСА-HA

По прототипу ГУ-НА

3,4 <0,1

15,8 <0,1

100 (0,1

100 4,4

По предлагаемому

О, 18+0905.1О

О 1 100 4 8 (0,1

ГУ-ДА

6,42*0,21 "10 к

4,85 0912 1О

О,! 100 3,7 <0,1

БТ-ДА

БСА-ДА

По прототипу БТ-ДА

0 1 100 4,2 <0,1

3,41х0,14 10

17,8 100 28,4 <0,1.

В таблице приняты следующие обозначения: ГУ вЂ” гемоциайин улитки, БТ вЂ” бычий тиреоглобулин, БСА — бычий сывороточный альбумин, НА " норадреналин, ДА — дофамин, HNH — норметанефрин.

Т а б л и ц а 2 олярное соотношение белок/норадреналинр пределяемое по методу

Конъюгированный антиген

1 пектрофотометрическому измерения радиоктивности

ГУ-НА

1:5

1:7

БТ-НА

БСА-НА

1:12

1:16

1:22

I 20 таблица3 ю «м °

Титры антител и полученных с - тках

Применяемый конъюгат прототипу

По пред

1:400

ГУ-НА

БТ-НА

БСА-НА

ГУ-ДА

БТ-ДА

БСЛ-ДА

ВИИИПИ Заказ 4089/7 . Тилак 688 ПаПлиаааа

Филиал 7878 "Патеит, т.ритеред, ул.Праеитий, а

1:1600

1:3200

1:6400

1:3200

1:1600

1:3200

1:400

1:800

1:800

1:400

1:400