Способ получения глюкоамилазы и белкового корма

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И БЕЛКОВОГО КОРМА, предусматривающий глубинное культивирование продуцента из рода Aspergillus с подсевом культуры дрожжевого организма вида Saccharomyces cerevisiae в культуральную жидкость и утилизацию остаточных Сахаров дрожжами, отличающийся тем, что, с целью создания безотходного производства , снижения себестоимости и улучшения качества целевого продукта , а также повышения выхода белкового корма, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют фосфорное, азотное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 10-15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают i СУ) отдельно. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве подсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи из рода Candida. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 10%-ного стерильного расо м створа диаммонийфосфата или аммиака. О5 vl со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) И1) ГОСУДАРСТВЕННЬ!Й КОМИТЕТ СССР (21) 3515189/28-13 (22) 25.11..82 (46) 15.06.84. Бюл. У 22 (72) Э.П. Москвичева, Л.С. Лосякова, К.А. Калунянц, Л.P. Джилавян;

А.Н. Маэуренко, А.А. Каменский и 3.В. Удалова (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (53) 577.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 507634, кл. С 12 D 13/06, 1973.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке У 3345896/28-13, кл. С 12 N 9/34, 1981.

3. Авторское свидетельство СССР

Ф 997455, кл. С 12 N 9/34, 1981. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И БЕЛКОВОГО КОРМА, предусмат" ривающий глубинное культивирование продуцента из рода Aspergillus c подсевом культуры дрожжевого организма вида Saccharomyces cerevisiae в культуральную жидкость и утилиза. З151) С 12 И 9/34//С 12 Р 39/00 цию остаточных сахаров дрожжами, отличающийсятем, что, с целью создания безотходного производства, снижения себестоимости и улучшения качества целевого продукта, а также повышения выхода белкового корма, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют фосфорное, азотное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 10-15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают отдельно.

2 Способ по п 1 о т л и ч аю шийся тем, что в качестве подсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи иэ рода Candida

3. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 1ОХ-ного стерильного раствора диаммонийфосфата нли аммиака.

1097673 l0

15 ао

30

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения ферментных препаратов глюкоамилаэы и белкового кормового продукта в условиях безотходного производства.

Известны способы интенсификации технологических процессов при производстве продуктов микробиологичес,кого синтеза путем совместного культивирования микроорганизмов.

Например, известен способ получения лизина, который предусматривает подсев в культуральную жидкость с остаточной концентрацией сахаров около 3% на логарифмической стадии роста продуцента не ассимилирующих лизин микроорганизмов Trichosporon

Cutaneum М-19 или Candida tropicàlis в количестве 0,1-1,2 вес.% (11.

Однако микроорганизмы подсевают в культуральную жидкость беэ учета оптимальных параметров их развития, не учитывается потребность подсеваемых микроорганизмов в дополнительном минеральном азотном и фосфорном питании, способствующем ускорению роста и более полному условию остаточных сахаров. Кроме того, подсев микроорганизмов в логарифмической фазе тормозит биосинтез ферментов.

Известен также способ получения амилолитических ферментов, предусматривающий совместное выращивание продуцента Aspergillus oryrae u дрожжей Saccharomyces .cerevisiae npu рН 5,3-3,5 в течение 20-40 ч (23.

Способ не позволяет получить амилолитические ферменты высокой активности, так как при совместном культивировании с одновременным засевом грибов и дрожжей последние, имея бо-. лее короткий цикл развития, быстрее и в большем количестве потребляют углеводы, а биосинтез глюкоамилазы не обедненной питательной среде замедляется. Способ не предусматривает утилизации остаточных непотребленных сахаров..

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения концентрированных ферментных препаратов, в том числе глюкоамилазы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента из рода

Aspergillus c подсевом культуры дрожжевого организма вида Saccharomyces cerevisiae в культуральную жидкость и утилизацию остаточных сахаров дрожжами. Культивирование ведут при начальном рН 3,8-5,6 температуре 30-35 С в течение 72о

144 ч до получения активности по глюкоамилазе 20-200 ед./мл. Подсев дрожжей осуществляют после отделения биомассы гриба, срабатывание ведется в анаэробных условиях в течение 24 ч до содержания остаточных сахаров 0,5-1,0% и концентрации спирта 3-5 об.X. Затем осуществляют концентрирование ферментно-спиртовой смеси ультрафильтрацией или выпариванием до получения концентрировàííîro Аерментноro препарата и спирта 3 (.

Способ не позволяет получить высокого содержания белка в биомассе из-за наличия в культуральной жидкости после сбраживания остаточных сахаров (0,5-1%).

Применение способа .на заводах микробиологической промышленности неэкономично.

Цель изобретения — создание беэотходного производства, снижение себестоимости и улучшение качества целевого продукта, а также повышение выхода белкового корма.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкоамилазы и белкового корма, предусматривающему глубинное культивирование продуцента из рода Aspergillus с подсевом культуры дрожжевого организма вида Saccharomyces

cerevisiae в культуральную жидкость и утилизацию остаточных сахаров дрожжами, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют азотное и фосфорное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 10-15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают отдельно. В качестве подсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи из рода Candida.

Фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 10%-ного стерильного раствора диаммонийфосфата или аммиака. э 1

Способ осуществляется следующим образом.

Продуценты глюкоамилазы из рода

Aspergillus культивируют на концентрированных питательных средах в аэробных условиях при 30-35 С и начальном значении рН 4,8-6,0 в течение 84-150 ч. За 10-50 ч до максимального образования глюкоамилазы на стационарной фазе развития продуцента в культуральную жидкость вводят стерильный раствор, содержащий источники азота и фосфора из расчета ожидаемого выхода воздушно-сухой юиомассы подсеваемых микроорганизмов по отношению к остаточным сахарам (соотношение остаточных сахаров, азота и фосфора рассчиты" вают по содержанию их в биомассе подсеваемых микроорганизмов), проверяют рН и доводят его значение до

3,5-6,0 добавлением стерильного раствора кислоты или щелочи. Подсевают культуру микроорганизмов, утилизирующих остаточные сахара, например дрожжи рода Candida или Saccharomyces, и проводят совместное культивирование при оптимальных условиях для развития дрожжей, т.е. при 30о

35 С,подаче воздуха 0,5 — 1,5м /м мин до прекращения размножения дрожжей (10-50 ч). Из полученной культуральной жидкости отделяют биомассу, например фильтрацией, и сушат раздельно ферментный раствор, содержащий глюкоамилазу, и биомассу.

Пример 1. Продуцент глюкоамилазы Aspergillus niger Т-33.куль тивируют в колбах на качалке при о

33 С в 100 мл концентрированной питательной среды, содержащей источники углеводов, азота, фосфора и биостимуляторы, при начальном значении рН 5,4. После 120 ч роста (за 30 ч до максимального накопления глюкоамилазы) активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет

110 ед./мл, остаточные сахара (по

РВ) 4,5%, сухие вещества (СВ) 8,2%, рН 3,3. В полученную культуральную жидкость на стационарной фазе развития продуцента добавляют дополнительное азотное и фосфорное питание в виде 10%.-ного стерильного раствора диаммоний фосфата в количестве

0,9% соли из расчета ожидаемого выхода воздушно-сухой биомассы дрожжей 45% от РВ, содержащей 3,5% фос097673

5о фора и 8% азота, доводят значение рН до 4,8 добавлением стерильного раствора щелочи, вводят посевной материал дрожжей Saccharomyces cerevisiae Т-7, выращенный на сусле, и проводят совместное культивирование в течение 30 ч при 30 С и подаче воздуха 1;5 м /м ° мин до прекращения размножения дрожжей.

Полученная культуральная жидкость имеет ГлС 105 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 0,26Х, СВ 4,8Х. Из полученной культуральной жидкости от-! .деляют биомассу фильтрованием и из фильтрата после высушивания его на распылительной .сушилке с наполнителем Ма.,804(150% по СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 780 ед./r. После высушивания биомассы получают 4,3 г/100 сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 44,1%.

Пример 2 Продуцент глюкоамилазы Aspergillus niger Т-33 культивируют при тех же условиях,что в примере 1. В культуральную жидкость с той же характеристикой, что в примере 1, вводят посевной материал дрожжей Saccharomyces cerevisiae paса 14 и проводят совместное культивирование при тех же условиях, что в примере 1.

Полученная культуральная жидкость имеет 1 12 ед./мл, PB 0,22Х

СВ 4,3. После отделения биомассы и сушки фильтрата с наполнителем NaC1 (150% по СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с ГлС 820 ед./r.

После высушивания биомассы получают

4,4 г/100 мл сухого белкового корма с содержанием сырого протеина

43,9Х.

Л р и м е р 3. Продуцент глюкоамилазы Aspergillus awamori Р— 122 культивируют в биолафите на концентрированной питательной среде при

35 С и начальном значении рН 4,8. о

После 67 ч. роста (за 30 ч до максимального накопления глюкоамилазы) в КЖ ГлС 175. ед./мп, PB 4,7Х, СВ 5,0%, рН 2,9. Полученную культуральную жидкость до подсева обрабатывают так же, как в примере 1, вводят посевной материал дрожжей

Saccxaromyces cerevisiae раса ХП, выращенных на сусле, и проводят совместное культивирование в течение 30 ч при 32 С и подаче.0 5 м /м о

3 1097673 б

5О

»:мин до прекращения размножения дрожжей. Полученная культуральная .жидкость имеет ГлС 168 ед./мл, РВ 0,2/7, СВ 3,97. Биомассу определяют фильтрацией и фильтрат сушат на распыпительной сушилке с наполнителем Иа ">0<(200% по отношению к СВ). Полученный препарат технической глюкоамилазы имеет ГлС

950 ед./r. После высушивания биомассы получают 4,1 г сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 43,2%.

Пример 4. Продуцент глюкоамилазы Лзр. niger. Т-33 культивируют в тех же условиях, что в примере !, После 140 ч роста (за 10 ч до максимального накопления глюкоамилазы) культуральная жидкость характеризуется активностью глюкоамилазы 115 ед./мл, РВ 5,2%, СВ 7,97, рН 3,1. Полученную культуральную жидкость обрабатывают, как в примере 1, после чего вводят посевной материал дрожжей Candida

tropica1is CI<-4, выращенных на сусле, и культивируют совместно в тео чекане 10 ч при 35 С и подаче воздуха 1,5 м /м мин до прекращения размножения дрожжей. Полученная культуральная жидкость имеет активность глюкоамилазы 115 ед./мл, остаточного сахара (no PB) 0,35%, СВ 4,6%. 1(ультуральную жидкость фи;тьтруют и из фильтрата путем высушивания его на распылительной сушилке с добавлением наполнителя

Ма 80 (150% по стношени о к СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 850 ед./r.

Бттомассу высушивают и получают 4 г

I из 100 мл культуральной жидкости) сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 437.

Пример 5, Продуцент глюкоамилазы Asp. avamori А-1 культивируют в колбах на качалке при 30 С в 100 мл концентрированной среды, содержащей те же источники питательных веществ, что в примере 1, но при начальном значении рН 6,0.

После 74 ч роста (за 10 ч до максимального образования глюкоамилазы) на стационарной фазе развития продуцента культуральная жидкость иг еет следующую характеристику: активность глюкоамнлазы 128,8 е./мл, остаточные сахара (по РВ) 6,67., СВ 10, 87, рН 5, 1 . Перед поде.евом дрожжей в культуральную жидкость вводят 1,37 диаммонийфосфата в виде 107.-ного стерильного раствора (из расчета, как в примере 1), доводят рН до 6,0 и в стерильных условиях засевают посевным материалом дрожжей Candida itilis, предвари— тельно выращенных на суспе. Совместное культивирование продолжают при

33 С и подаче воздуха 1,0м /м".мин до прекращения размножения дрожжей (10 ч).

Получают культуральную жидкость с активностью глюкоамилазы 136 ед./мл, содержанием остаточного сахара (по

РВ) 0,257 и СВ 4,8%. Биомассу отделяют фильтрованием, высушивают и получают 4,2 r (из 100 мл культуральной жидкости) воздушно-сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 44,87. Фильтрат культуральной жидкости высушивают на распылительной сушилке с добавлением наполнителя NaC1 (100% по СВ) и получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 960 ед./мл.

Пример. 6. Продуцент глюкоамилазы Asp. awamori F — 122 вырас щивают т ри 35 С в ферментере полезной емкостью 35 л на концентрированной питательной среде, содержащей те же источники питания, что в примере 1„ но при начальном значении рН 4,8. После 67 ч роста продуцента в стационарной фазе развития

его (за 50 ч до максимального накопления глюкоамилазы) в культуральной жидкости накапливается 168,8 ед. /мл глюкоамилазы, а содержание остаточных сахаров снижается до 4,627., СВ составляет 10,2%, рН 2,95. Перед подсевом дрожжей в ферментер вводят раствор аммиака 0,567 (из расчета, как в примере 1) и доводят рН до 3,5 раствором ортофосфорной кислоты. В культуральную жидкость в стерильных условиях подсевают посевной материал дрожжей Candida .rhoreae, выращенных на сусле. Совместное культивирование проводят при 30 С и подаче воздуха 0,5 м /м, хмин в течение 50 ч до прекращения размножения дрожжей.

Получают культуральную жидкость с активностью глюкоамилазы 185 ед./мл и содержанием остаточных сахаров (по РВ) 0,32%, СВ 6, 1%. Биомассу

Составитель Е. Ворьбьева

Техред И.Асталош Корректор А. Тяско

Редактор Л. Веселовская

Заказ 4152/24

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 109 отделяют фильтрованием и сушат, а фильтрат очищают и концентрируют с последующим высушиванием на распылительной сушилке с добавлением наполнителя Na01 (1007 по СВ). Получают препарат очищенной глюкоамилазы с активностью 4750. ед./мл и 45 r воздушно-сухого белкового корма (из 1 л культуральной жидкости) с содержанием сырого протеина 42,8Х. 10

Пример 7 (контроль),. Иродуцент глюкоамилазы Asp. awamori Р-122 культивируют в колбах на качалке при

35 С в 100 мл концентрированной питательной среды, содержащей источники 5 углеводов, азота, фосфора и стимуляторы роста. В середине логарифмической фазы развития продуцента (45 ч ферментации) культуральная жидкость имеет следующую характеристику: актив- ур ность глюкоамилазы 105 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 4,8Х, СВ

9,7Х, рН 2,9. В культуральную жидкость вносят посевной материал дрожжей Candida tropicalis СК-4 и осу- 25 ществляют совместное культивирование при 31 С и аэрации 1,0 м /мз мин, поддерживая рН среды 6,5. Процесс культивирования продолжают до минимального содержания сахаров в куль7673 8 туральной жидкости (в среднем 112 ч).

Полученная культуральная жидкость имеет глюкоамилазную активность

88,2 ед./мл, остаточные сахара (по

РВ) 1,257, СВ 5,77. Иэ культуральной жидкости выделяют биомассу, а фильтрат уларивают до содержания сухих веществ 32,97., a затем сушат на распылительной сушилке. В процессе высушивания препарат налипает на стенки сушилки.

Таким образом, используя предла" гаемый способ получения глюкоамилазы и белкового корма, можно, получить порошкообразные ферментные препараты технической глюкоамилазы при культивировании высокоактивных продуцентов на концентрированных питательных средах товарного вида, создать безотходное производство препаратов глюкоамилазы ; улучшить качество препаратов глюкоамилазы по гигроскопичности, получить белковый кормовой продукт, по содержанию сырого протеина соответствующий БВК, снизить себестоимость препаратов глюкоамилазы на 10-157..

Ожидаемый годовой экономический эффект от внедрения предлагаемого способа составит 3582,36 тыс.руб.