Способ дифференциации грибов @ . @ и @ . @ от других дрожжеподобных грибов

 

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГРИБОВ C.ALBICANS И C.TROP1CALIS ОТ ДРУГИХ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ, включающий вьфащивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содержалцей сьшоротку крови и лактозу,определение морфологических особенностей, культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию изменения цвета культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве индикатора используют метиловый красньй, а перед добавлением индикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в -течение 4-6 ч в среде, содержащей сахарозу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации используют изменение окраски культуральной жидкости соот (Л ветственно после добавления в нее С индикатора и изменения цвета среды дополнительного культивирования.

СООЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИН

091 Ol) з ц) С 12 N 1/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ 1 - я (21) 3536876/30-15 (22) 07.01.83 (46) 23.07.84. Бюл. 11> 27 (72) Е.В.Себряков (71) Донской ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственный институт (53) 682.282.23(088.8) (56) 1. Себряков Е.В. Профилактика и лечение заболеваний с/х животных.

Сборник ДонСХИ, 1978, т. 13, вып. 3, с.30"36.

2. Себряков Е.В. Ферментативная активность грибов рода Сап11Л1а.

Сб ° научи ° трудов ДонСХИ, 1980, т. 15, вып. 2, с. 73-78 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГРИБОВ С.ALBICANS И С.TROPICALIS ОТ

ДРУГИХ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ, вклю.чающий выращивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содержа.щей сыворотку крови и лактозу,определение морфологических особенностей, культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию изменения цвета культуральной жидкости, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве. индикатора используют метиловый красный, а перед добавлением индикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в течение

4-6 ч в среде, содержащей сахароэу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации используют изменение Е окраски культуральной жидкости соответственно после добавления в нее индикатора и изменения цвета среды дополнительного культивирования, 1104153

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной микологии, и может быть использовано при микологической диагностике кандидамикозов. 5

Известен ускоренный способ дифференциации грибов С. albicans u

С. tropicalis при их культивировании в натинной сыворотке крови, в которой при определенных условиях эти грибы через 24-48 ч инкубации образуют псевдомицелий,. что можно использовать для дифференциации этих грибов от других дрожжеподобных организмов (1) . l5

Однако указанный способ не обеспечивает высокой точности при дифференциации этих грибов, что обусловле но значительной изменчивостью дрожжеподобных гриГов и недостаточной 20 изученностью их морфологических особенностей.

Известен способ дифференциации грибов С. albicans и С. tropica1 is от других дрожжеподобных грибов, 25 включающий выращивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содержащей сыворотку крови и лактозу, определение морфологических особенностей культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию рН по изменению цвета культуральной жидкости j2) .

Однако известный способ является довольно громоздким и требует длительного времени (24-48 ч).

Целью изобретения является повышение эффективности способа.

Цель достигается тем, что согласно способу дифференциации грибов 4О .С.albicans (:. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, включающему выращивание культуры грибов в течение

20-24 ч в среде, содержащей сыворотку крови и лактозу, определение мор- 45 фологических особенностей культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию изменения цвета культуральной жидкости, в качестве индикатора используют метиловый красный, а перед добавлением индикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в течение 4- 6 ч в среде, содержащей сахароэу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации используют 55 изменение окраски культуральной жидкости соответственно после добавления в нее индикатора и изменения цвета среды дополнительного культивирования.

Способ осуществляют следующим образом.

В сыворотку крови добавляют антибиотики (стрептомицин и пенициллин по 200-300 ед. на 1 мл), стерилизуют фильтрацией через асбестовую пластинку (СФ) в фильтре Зейтца, подкисляют

1 и. раствором соляной кислоты до рН 6,1-6,3 и добавляют по 20 об. 7, стерильного 157.-ного раствора лактоэы на дистиллированной воде. Проверяют рН среды, который должен быть равен

6,2-6,4. При необходимости среду подкисляют или подщелачивают стерильным

1 н. раствором соляной кислоты или едкого натрия. Среду асептически раз" ливают в стерильные аглютинационные пробирки, примерно по 2,5 мл, закрывают марле-ватными пробками и хранят в рефрижераторе при 2-4 С.

Посев гриба производят 24-часовой культурой, выращенной на агаре Сабуро с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось примерно 5-7 млн. клеток гриба (определение по оптическому стандарту). Пробирку с посевом культуры гриба помещают в штатив ШСА (штатив для скашивания arapa) в наклонном положении под углом 10-15, что создает оптимальные условия аэрации культуры.

Через 20-24 ч инкубации при 37 С определяют морфологические особенности культуры гриба.

При микроскопическом исследовании культуры гриба С. albicans обнаруживают длинные извитые, часто переплетающиеся нити псевдомицелия с овальными или округлыми бластоспорами, расположенными в местах сочленения сильно удлиненных клеток псевдомицелия. В культуре гриба С. tropicalis преобладают длинные прямые, ветвистые нити псевдомицелия с овальноудлиненными бластоспорами, расположенными в местах сочленения клеток псевдомицелия. В культуре других дрожжеподобных грибов преобладают овальные или овально удлиненные дрожжевидные клетки, иногда обнаруживаются короткие нити псевдомицелия, состоящие преимущественно из 3-6 клеток.

Окончательную дифференциацию грибов С.albicans и С.tropicalis производят после определения дегидрогеназной активности культуры гриба и ак1104153 добавляют 2-3 капли метилового красного, приготовленного по общепринятой методике.

Видовую принадлежность грибов опрецеляют по таблице.

Как видно иэ таблицы, изменение цвета среды с реэазурином из синефиолетового в малиновый или красный в течение 4-6 ч и желтая окраска культуральной жидкости после добавления метилового красного позволяет с высокой точностью дифференцировать грибы С.albicans и С.t.ropicalis от других дрожжеподобных грибов.

Предлагаемый способ позволяет за короткое время (24-28 ч) дифференцировать с высокой точностью грибы

С. albicans и С.tropicalis, которые являются наиболее частыми возбудителями кандидамикоэа, поэтому диФференциация этих грибов от других дрожжеподобных грибов представляет существенный практический интерес для микологической диагностики этого заболевания и проведения своевременных лечебно-профилактических мероприятий;

Цвет среды при постановке дегидрогеназной пробы

Вид гриба

Сразу после Через 4-6 ч постановки инкубации

С.a lb icans

Сине-фиолетовый

Малиновый, красный или розовый

Малиновый, красный или розовый

Фиолетовый

Желтый

Желтый

С.krusei

Желтый

Сине-фиолетовый

Фиолетовый

Красный или оранжевый

Желтый

Малиновый, красный или розовый

Фиолетовый, иногда с темномалиновым кольцом поверхности среды

Фиолетовый

С.pseudotropical is или краснофиолетовый

Сине-фиолетовый

С.parakrusei

Желтый

С.Gwilliermondi

Сине-фиолетовый или темномалиновый

ВНИИПО Заказ 5165/17 Тираж 522 Подписное

Филиап ППП "Патент", r. Ужгород,ул.Проектная, 4. тивной реакции (рН) культуральной жидкости. С этой целью применяют среду, приготовленную на фосфатном буфере с рН 6,35-6,45, содержащую

20Ж сахароэы, 1,57. агар-агара. После двухкратной стерилизации текучим паром рН среды равен 6,10-6,25. Раствор резазурина готовят на дистиллированной воде: растворяют 1 таблетку (50 мг) индикатора в 25 мл стериль l0 ной воды и кипятят на водяной бане

20 мин. Концентрация индикатора 0,027..

В стерильную бактериологическую пробирку к 1 мл расплавленной и охлажденной до 45-50 С агаризированной среды с сахарозой добавляют 0,2 мл раствора реэазурина и 1 мл культураль. ной жидкости, содержащей 20-24-часовую культуру гриба, выращенную в сыворотке крови с лактоэой. Содержимое пробирки перемешивают, помещают в обычный штатив и инкубируют в термостате при 37 С в течение 4-6 ч.

Одновременно определяют активную реакцию культуральной жидкости (рН)

20-24-часовой культуры гриба, выращенной в сыворотке с лактозой.

К 1-1,5 мл культуральной жидкости

С.tropicalis Сине-фиолетовый

Цвет культуральной жидкости после добавления индикатора метиленового красного