Способ получения конъюгированных антигенов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ, предусматривающий активацию бензидина и связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем при рН 7-8, отличающийся тем, что, с целью улучшения иммунохимических свойств получаемого продукта, активацию бензидина осуществляют окислением его пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода при массовом соотношении реагентов

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

И

РЕСПУБЛИН

169 А (ИР (31) 9 00, ГОСУДа СТЕЕННЫй НОМИТЕТ CCCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНР зЩ Й

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ " " " ал

) (21) 3579420/28-13 (22) 08.04.83 (46) 23.08.84. Бюл. Р 31 (72) Л.А.Пирузян, И.Е.Ковалев, О.Ю.Полевая, Т.Н.Робакидзе, Н.П.Данилова, С.Л.Шумова и Н.Ю.Томилина (71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (53) 576.8.097(088.8) (56) 1. 1 оростелева Т.А., Потапенкова Л.С.Сравнительное изучение канцерогенной активности и иммунологической специфичности аминоазосоединений. — "Гигиена труда и профессиональные заболевания", 1978, Р 5, с. 24-27.

2. Полевая О.Ю., Башарова Л.А., Ковалев И.F,.Êîâàëåíòíîå связывание этаперазина с белком для получения антител, нейтрализующих физиологическое действие этаперазина. — "Химико-фармацевтический журнал", 1976, В 9, с. 15-19. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ, предусматривающий активацию бензидина и связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым .носителем при рН 7-8, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью улучщения иммунохимических свойств получаемого продукта, активацию бензидина осуществляют окислением его пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода при массовом соотношении реагентов (1-10):5:(0,6-2,4), а связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем проводят при весовом со- 3 отношении соответственно (6,6-17,4):

:20.

1 11091

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу получения конъюгированного антигена бензидин — антигенный носитель, который может найти применение в медицине и биологии для получения антител к бензицину, а также для определения концентрации и локализации бензидина в жидкостях и тканях организма. I0

NaNOg ® О) И2я l 1 / ЗН2, ВС1 Н20 / / 24=-ЖС1

Таким образом, известный способ отличается высокой специфичностью выявления антитела к бензидину и/или бензидина, связанной с модификацией молекулы гаптена (изменение пространственной органиэации молекул гаптена).

Цель изобретения — улучшение иммунохимических свойств получаемого продукта. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов, предусматривающему активацию бензидина и связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем при рН 7-8, активацию бензидина осуществляют окислением его пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода при массовом соотношении реагентов (1-10):5:(0,62,4), а связывание активированного производного бензидина с антигенным белковым носителем проводят при весовом соотношении соответственно (6,617,4):20.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что согласно способу получают новые реакционноспособные производные бензидина (свободные радикалы и хинонимины) окислением бензидина пероксидазой хрена в присут ствии перекиси водорода. Эти реакционноспособные производные при взаимодействии с белковым антигенным носителем образуют гетерогенную смесь конъюгированных антигенов, отличающихся положением присоединения бензидина к белку, в которых молекула исходного гаптена не модифицируется.

Очистку конъюгированного антигена проводят колоночной гель-хро20 матографией на сефадексе 6-25. Получают конъюгированные антигены, содержащие от 8 до 17 молекул бензидина на одну молекулу белкового антигенного носителя (1J.

Недостатком этого способа получения конъюгированных антигенов (KA) бензидин — белок является невысокое качество образующегося целевого продукта, которое обусловлено тем, что

30 молекула исходного бензидина (гаптен) существенно модифицируется, в ней исчезает аминогруппа и появляется новая азо-связь, в результате чего поверхность молекулы гаптена изменяется. Поэтому антитела, полу- З5 ченные с помощью такого КА, лучше .связывают модифицированное производное бензидина, чем исходный бензидин, что свидетельствует о существенном иммунохимическои недостатке

40 этого конъюгированного антигена.

Кроме того, в КА имеется только один участок связывания бензидина с белком, поэтому антитела, индуцируемые таким КА, направлены также толь— 45 ко к одному участку молекулы гаптена, противоположному месту присоединения его к белковому носителю. В результате указанного при использовании в реакции пассивной гемагглютина- 5О ции (РПГА) конъюгированного антитела бензидин — белок, полученного диазоспособом, не удается выявить низкий уровень иммунного ответа— антитела к бензидину в сыворотке 55 крови животных, длительно получавших бензидин (выявляемый титр

1: 256) .

69 1

Изнестен способ получения коньюгированных антигенов, предусматривающий активапию бензидина диазотитрованием его нитритом натрия в концентрированной соляной кислоте при 0-2 С и связывание активированного производного бензидина — его диазониевой соли с антигенным белковым носителем в реакции азосочетания при рН 7-8 и весовом соотношении 1:20, 1! 09169 л — белок) ВНЕ где — другие возможные места присоединения бензидина.к белку.

В результате таких превраЩений получают КА с повышенным качеством " 20 улучшенными иммунохимическими характеристиками. С помощью полученного предлагаемым способом конъюгированного антигена бензидин — белок выявляются антитела к бензидину у животных, ко- 25 торым вводили длительное время этот канцероген per os, выявляемый титр

1:512, что недоступно для КА, полученного известным диазометодом, Кроме того, при иммунизации животных 30 конъюгированными антигенами, полученными предлагаемым и известным способами, индуцируются антитела различной специфичности. Антитела, полученные с помощью предлагаемого способа, в незначительной степени перекрестно реагируют с вторым конъюгированным антигеном и наоборот.

В предлагаемом способе получения

KA бензидин — антигенн |Й HocHTBJIb 40 реакционноспособное производное бензидина получают при добавлении к раствору бенэидина в диоксане раствора пероксидазы хрена и перекиси водорода в фосфатном буфере при рН 7-8 в указанном весовом соотношении при

20-25 С. Смесь добавляют к 0,57-ному раствору антигенного белкового носителя в фосфатном буфере при рН 7-8 в весовом отношении (б,б-17,4):20 соо ответственно при 0-25 С.по каплям при перемешивании, инкубируют. 10 мин. КА бензидин — белок очищают от низкомолекулярных продуктов реакциии пероксидаэы хрена колоночной гель-хроматографией на акрилексе П-б0. Количество

55 бензидина в КА определяют спектрофотометрически 1,2). В зависимости от соотношения реагентов получают конъю-. гированные антигены бензидин — антигенный носитель, в которых с одноймолекулой белка ковалентно связано 540 молекул бензидина.

В предлагаемом способе соотношение бензидина, белкового носителя и системы пероксидаза — перекись водорода, активирующей бензидин, выбрано в таких пределах, при которых образуется конъюгат оптимального качества, т.е. содержащий 5-40 молекул бензидина на одну молекулу антигенного носителя. При меньшей посадке гаптена на антигенный .носитель ухудшаются его антигенные свойства, при большем замещении возможны побочные явления при иммунизации животных, кроме того, ухудшается растворимость КА, Выбранный интервал температуры и величина рН дозволяет проводить реакцию ковалентного связывания бенэидина с антигенным носителем с достаточно высокой скоростью при стабильности фермента и белкового антигенного .носителя.

Иммунохимические исследования проводят на различных группах кроликов, иммунизированных КА, полученными диазометодом и предлагаемым способом, а также на.группе крыс, кормленных длительное время бензидином. Наличие антител к:бензидину определяют в сыворотке крови иммунизированных и получавших гаптен per os животных стандартной

РПГА и реакцией торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), используя эритроциты барана (ЭБ), сенсибилизированные соответствующими аитигенами. Максимальный титр антител к бенэидину у животных, иммунизированных КА бензидин — антигенный носитель, полученным предла11091

45

S гаемым способом, составляет 1:512, а у животных, иммунизированных КА, полученным диазометодом — 1:256, Антитела, индуцируемые первым конъюгированным антигеном, дают слабые перекрестные реакции со вторьп4 КА и наоборот. Определяют низкий уровень иммунного ответа (титр антител

1:32) на бензидин в сыворотке крови крыс, длительно кормленныХ гап- 10 теном, лишь с помощью конъюгированного антигена бензидин - белок, полученного предлагаемым способом.

Пример 1. Способ пдлучения

КА бензидин-бычий сывороточный альб умин.

К 10 мг (3,5, 10 М) бензидина в 0,5 мл диоксана добавляют 5 мг (1,1-10 И) пероксидазы хрена в

1 мл О, 1 М фосфатного буфера рН 7,4 и 0,8 мл (6,4 -10 "5M) О,ЗЖ-ного раствора перекиси водорода. Смесь перемешивают и по каплям добавляют к раствору бычьего сывороточного альбумина 20 мг в 2 мл 0,1 М 25 фосфатного буфера рН 7,4. Реакционную массу инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.

Полученный конъюгат бензидин-бычий сывороточный альбумин очищают колоночной гель-хроматографией на акрилексе П-60. По данным спектрофотометрии с одной молекулой .белка в КА ковалентно связано 29 молекул бензидина.

Пример 2. Способ получения

КА бензндин-бычий сывороточный альбумин.

К 1 мг (3,5 .10 М) бензидина в 0,5 мл диоксана добавляют 5 мг (1,1 ° 10 М) пероксидазы хрена в

1 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 и 0,2мл.(1,6.10 М) О,ЗЖ раствора перекиси водорода. Далее реакцию проводят аналогично примеру 1.

Получают КА, в котором с первой молекулой белка ковалентно связано

40 молекул бензидина.

Пример 3. Способ получения

КА бензидин-бычий сывороточный

50 альбумин.

К раствору 5 мг (1,7 -10 М) бензидина в 0 5 мл диоксана добавляют пероксидазу хрена и перекись водорода в соотношении, указанном в

55 примере 2. Далее реакцию проводят аналогично примеру 1. Получают КА, в котором на одну молекулу белка приходится 15 молекул бензндина.

Пример 4. Антигенные свойства КА бензидин-бычий сывороточный альбумин. Кроликам весом 2 кг вводят внутрикожно в 10-15 разных точек

5мг/кг веса животного конъюгированный антиген, полученный по примеру 3, в смеси!с равным. объемом полного адъюванта Фрейнда. Аналогичную иммунизацию проводят через 7 дней.

Через две недели дважды с интервалом в 7 сут животным вводят КА внутримьппечно в дозе 10 мг/кг без адъюванта. Спустя месяц проводят реиммунизацию четырьмя внутримышечными инъекциями KA 10 мг/кг с недельным интервалом. Через семь дней после последней иммунизации у животных берут кровь из краевой ушной вены и определяют титры антител к бензидину с помощью РПГА.

Реакцию РПГА проводят на полистироловых пластинках, В каждую лунку пластин вносят по 0,025 мл среды рН 8,2. Затем в первую лунку каждого ряда добавляют по 0,025 мл иммунной сыворотки, предварительно декомплементированной при 56О в течение 1 ч. Далее сыворотку раститровывают и добавляют в каждую лунку 0,025 мл 17 -ной суспензии ЭБ, сенсибилизированных КА бензидин-бычий сывороточный альбумин, полученным известным химическим или предлагаемым методом. Пластины инкубируют при

37 С в течение двух часов. Оценку агглютинации проводят визуально по характеру осадка в лунках. Реакция считается положительной, когда наблюдают агглютинацию ЭБ при отсутствии агглютинации в контрольных лунках (без иммунной сыворотки)..

Сравнительные иммунохимические характеристики КА представлены в таблице 1. В прямых РПГА титр антител к КА бензидин-бычий сывороточный альбумин, полученному химическим диазоспособом, составляет

-log, = 21, синтезированному предлагаемым методом -log = 24. Низкий уровень иммунного ответа на длительное кормление..крыс бензидином удается выявить лишь с помощью ЭБ, сенсибилизированных КА, полученным предлагаемым способом, титр антител составляет log = 5.!

1 (I

1109169 f . I

+ +

+ . + !

+ .+ Ф

». »

+ + 1

» !

+ . Ф

+ t

+ I

5

e e

Ыб g5

I

2 0t м о ь р3 +34 ее

Составитель О.Скородумова

Редактор О.Бугир Техред O.Êåöå Корректор В.Бутяга

Заказ 5970/5 Тираж 688 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 9

Таким образом, при использовании предлагаемого способа получения коньюгированного антитела бенэидинантигенный носитель по сравнению с известным повышается качество реагента для иммунохимическпх исследований. В известном диазометоде исходный гаптен модифицируют при ковалентном связывании с белковьм антигенным носителем. В предлагаемом способе образуется смесь КА, о

1109169 10 личающихся лишь положением присоединения бензидина к белку. Иммунохимические экспЬрименты показывают различие антигенных детерминант срав"

5 ниваемых коньюгированных антигенов, причем с помощью КА, полученного предлагаемым способом, определяют низкий уровень иммунного ответа — наличие антител к бензидину в

1п сыворотке крови животных длительно т- получавших гаптен.