Способ получения сайт-специфической эндонуклеазы @ @

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ECO Rl, вклюнающий культивирование штамма Ё-СоП RY 13, разрушение клеток, очистку фермента, о т личающийся тем, что, с целью повышения чистоты эндонуклеазы Е.со RI, очистку фермента ведут нутем хроматографии субстрата на голубой сефарозе с последующим изозлектрофокусированием при рН 3,5-10 в градиенте плотности глицерина 0,1-60% и отбором фракций при р1 7,7-8,0.

СООЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3 511 С 12 N 15/00; С 12 N 9/l0

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3577257/30 — 15 (22) 21.04.113 (46) 23.10.84. Бюл. Р 39 (72) С. С. Дебов, И. И. Никольская-Санович, Т. М. Упорова, С. В. Сучков и И. М. Карташова (71) Научно-исследовательский институт меди- цинской энзимологии АМН СССР (53) 577.15.02 (088.8) (56) 1. Smith Н. О. et а1. 1.Med.Bio1., 51, s. 79, 1970.

2. Roberts В. I. Nuc1. Arids Res, 10, 5, 1982.

3. Rubin R. at а1. Methods in Enzymolo— ду, 65, 96. 1980..э0 1120019 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САИТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКИЕАЗЫ ЕСО Rl, включающий культивирование штамма Е-Со11 RY 13, разрушение клеток, очистку фермента, и тличающийся тем,что,сцелью повышения чистоты эндонуклеазы Е,со Rl, очистку фермента ведут путем хроматографии субстрата на голубой сефароэе с последующим изоэлектрофокусированием при рН 3,5 — 10 в градиенте плотности глицерина

0,1 — 60% и отбором фракций при рl 7,7-8,0.

1120019

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения сайт-специфической эндонуклеазы EcoRI.

Рестриктазы широко используются в молекулярно-биологических, генно-инженерных и генетических экспериментах каК уникальный инструмент для получения и анализа рекомбинантных ДНК, выделения индивидуальных генов, картирования геномов прокариот, изучения первичной структуры ДНК. Использование рестриктаз основано на том, что эти ферменты являются сайт-специфическими, узнают и расщепляют в двунитевой ДНК определенные уникальные нуклеотидные последовательности — сайты. Первый фермент такого типа выделен в 1970 году Смитом и сотр (1) .

В настоящее время вьщелено более 280 рестриктаз, узнающих 85 типов различных последовательностей нуклеотидов (2) .

В то же время успешное использование рестриктаз для получения рекомбинантных

ДНК in vitro, встраивания в векторные молекулы, получения фрагментов ДЙК и т.д, возможно только в том случае, когда исполь- 25 зуемый способ выделения фермента обеспечивает отделение этого препарата от других, присутствующих в объекте рестриктаз. Одной из рестриктаз, наиболее широко используемых во всех видах молекулярно-биологических и генно-инженерных работ, является рестриктаза Есо Rl. Объектом для выделения рестриктазы EcoRI служат клетки Е.coli, содержащие плазмиду RI, которая детерминирует синтез двух специфических эндонуклеаз (рестриктаз)

EcoRI и EcoRI, имеющих родственные сайты узнав ания.

Рестриктаза EcoRI имеет 5 точек расщепления на ДНК фага лямбда и 1 точку расщепления на ДНК плазмиды pBR 322 и узнает уникальную шестичленную последовательность нуклеотидов 5 .

Оптимальными условиями для действия рестриктазы EcoRI являются высокая ионная сила и нейтральные значения рН.

Сайтом узнавания для рестриктазы EcoRI, является четырехчленная последовательность нуклеотидов 5 ...ААТТ...З, Фермент имеет девять точек расщепления на ДНК плазмиды

pBR 322 и более 20 точек расщепления на 50

ДНК фага лямбда, наиболее активен в среде с низкой ионной силой при щелочных значениях рН, в присутствии гицерина и ионов

++

М.п . Однако свежевьщеленный фермент в высокой концентрации способен расщеплять 55 субстрат как и рестриктаза EcoRI, в среде с высокой ионной силой при нейтральных . значениях ðÍ.

Ввицу того, что сайты узнавания для рест-. риктаз EcoRI и EcoRI, частично совпадают, определение активности рестриктазы EcoRI в смеси ферментов Fco R I u Eco R I в следующих случаях невозможно.

При совместном (одновременном или последовательном) воздействии на субстрат двумя или несколькими специфическими эндонуклеазами, одной из которых является рестриктаза EcoRI. Процецура совместного гидролиза субстрата различными рестриктазами широко используется в молекулярно-биологических экспериментах для картирования вирусных и плаэмидных геномов, при определении первичной структуры фрагментов ДНК, при идентификации сайтов, узнаваемых рестрикта-. зами. В таких экспериментах варьирует ионная сила среды, значение рН и набор катионов, вводятся стабилизирующие факторы типа глицерина, что в случае EcoRI и EcoRI, ферментов приводит к резкой активации

EcoRI, рестриктазы и полному маскированию.действия рестриктазы ECORI за счет появления большого количества EcoRI -специфических фрагментов ДНК.

Появление EcoRI -специфических фрагментов ДНК имеет место при использовании свежевыделенного ферментного препарата. В этих случаях рестриктаза EcoRI, как и ресгрикгаза EcoRI, способна гидролизовать субстрат в среде с высокой ионной силой при нейтральных значениях рН. Из сказанного следует, что получение рестриктазы EcoRI, свободной от сопутствующего фермента

EcoRI является обязательным условием ! всестороннего использования рестриктазы

EcoRI в молекулярно-биологических работах.

Способы получения рестриктаз традиционны.

Получение рестриктазы EcoRI состоит из ряда этапов: накопление бактериальной массы. разрушение клеток; получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот, высаливание, катионообменная хроматография на фосфоцеллюлозе РН, анионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе, адсорбционная хроматография на гидроксиапатите, афинная хроматография на ДНК-целлюлозе, стабилизирующий диализ (3), Однако ионообменники и адсорбенты обла,— дают незначительной емкостью, в результате чего значительная часть материала либо не связывается с обменником, либо связывается неспецифически и обнаруживается в оттекающей жидкости или при промывке обменника вместе с балластным белком, нуклеазами и е протеазами. Такой материал загрязнен, нестабилен и в дальнейших экспериментах не используется. Причем разрешающая способность анионообменников и адсорбентов недостаточна

3 11200 для белков со сходными физико-химическими свойствами, а использование афинной хроматографии не обеспечивает фракционирования белков, обладающих близким сродством к субстрату, 5

Таким образом, укаэанные типы колоночной хроматографии не обеспечивают разделения специфических эндонуклеаз Есой! и

Есо R! .

Предлагаемый способ исключает использование ионообменной и адсорбционной хроматографии, заменив ее двустадийным фракпио. нированием. На афинном сорбенте — голубой сефарозе и изоэлекгрофокусированием на амфолинах в градиенте рН и плотности глицерина.

Способ хроматографии на голубой ссфарозе является оптимальным на первой стадии о пгстки рестриктируюших эндонуклеаз, так как лозвояяет фракционировать ф pMeHTM непосредственно из грубого экстракта, исключив традиционные стадии осаждения нуклеиновых кислот и высаливания белков. Высокая емкость и разрешающая способность голубой сефарозы дают возможность провести с высокой эффективностью очистку фермента от неспецифических нуклеаз из любого заданного кнличсства бактериальной пасты.

Разделение белков методом изоэлектрофокусирования основано на способности белков

30 мигрировать в условиях электрофореза в зону рН, соответствующую изоэлектрической точке (ИЭТ) данного белка. Поскольку значение ИЭТ является уникальной характеристикой каждого белка, то различные белки отличаются друг от друга по этому признаку. Высокая разрешающая способность метода изоэлектрофокусирования позволяет разделять белки, значение ИЭТ которых различается на 0,2 ед рН.

Принцип фракционирования при условии правильного подбора крутизны градиента обеспечивает высокую степень концентрирования индивидуального белка в узкой зоне, высокую емкость колонки, эффективное отделение от балластных и интерферирующих ферментов, высокую чистоту полученного препарата. Выход белка значительно превышает таковой по сравнению с другими видами колоночной хроматографии, так как процедура исключает потери за счет материала, не связавшегося с обменником или адсорбентом. Использование изоэлектрофокусирования обеспечивает отделение специфической эндонуклеазы Есо Rl от специфической эндонуклеазы EcoRI, а также от интерферирующих ферментов — неспецифических эндо- и экзонуклеаз. Изоэлектрофоку- 55 сиравание проводится в градиенте плотности ,глицерина,. что позволяет опустить обычную при выделении рестриктаз заключительную

19 4 стадию стабилизирующего диализа с сохранением активности рестриктазы EcoRI в течение года.

Целью изобретения является повышение чистоты эндонуклеазы ЕcoRI, Цель достигается тем, что согласно способу получения сайт-специфической эндонуклеазы

EcoRI, включающему культивирование штамма F.Coli R Y 13, разрушение клеток, очистку фермента, очистку фсрмента ведут путем хроматографии субстрата на голубой сефарозе с последую цим изоэлектрофокусированием при pll 3,5--10 в градиенте плотности глицерина О,1 — 60% и отбором фракций при

pl 7,7-8,0.

Пример 1. Штамм Е.coli R Y 13 выращивачот на бульоне Хопингсра до начала стационарной фазы. Клетки осаждают центрифугированием. Выход биомассы по сырому весу 30 г/л. Затем клетки суспендируют в рабочем буфере с рН 7,6, содержащем

0,02 М трис-НС1, ионы М и р-меркаптоэтанол, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием в течение 1 ч при 105000

Объем недосадочной жидкости доводят до

100 мл рабочим буфером и наносят на колонку. размером 1,2х20 см с голубой сефаразой 4 В (Pharmacia), уравновешенную тем же рабочим буфером. Колонку промывают двумя объемами буфера и фермент элюируют линейным градиентом концентрации NaC1 0,1 — 1,0 М, Фракции, содержащие активность EcoRI, элюируют 0,35—

0,6 М NaCI, объединяют и обессоливают диализом против 0.001 M трис-НС1 буфера, содержащего 7 мм р-меркаптоэтанол и 0,5%-ный тритон. Полученный материал подвергают изоэлектрофокусированию на колонке с 1 -ным амфолином в градиенте плотности глицерина

О 1-60%.

Клетки Е.col i R Y 13 выращивают в течение 5 ч до стационарной фазы роста, центрифугируют при 5 тыс об/мин, полученную бак; териальную массу разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора. Озвученный экстракг подвергают высокоскоростному центрифугированию при 105000 q, в течение

90 мин. Недостаточная жидкость представляет собой грубый экстракт, который далее подвергают хроматографии на голубой сефарозе.

Изоэлектрофокусиров ание фракций, содержащих активность EcoRI, проводят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 4.0 — 6,0 в условиях градиента плотности глицерина 60 — 0,1%. Изоэлектрофокусирование ведут 16 ч при 600 Ч и затем 48 ч при 1000 V. В результате изо" электрофокусирования в таком диапазоне тазную активность тестируют с помощью вертикального электрофореза в агарозном геле. Гель окрашивают раствором этидийбромида в концентрации 3 мкг мл в течение

20 мин и фотографируют в ультрафиолетовом свете при 254 нм с красным светофильтром.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение ч. Всего из 10 г биомассы получено 300000 ед. активности. Пригодность полученного фермента для структурных исследований ДНК и опытов по конструированию

in vitro реаомбинантных молекул ДНК определяют следующим образои1.

Освобождение препарата фермента EcoRI от специфической эндонуклеазы ЕсоЕИ определяют при инкубации полученного фермента с ДНК фага лямбда в среде, оптимальной для проявления ВсоЕЕ!-активности. Состав инкубационной срецы: 0,025 М трис-HCI, 0,002 М М С1, рН 8 5Отсутствие неспецифических эндонуклеаз определяют при 6-ти часовой инкубации репликативной формы ДНК фага Х 174, не имеющей сайта узнавания для фермента

EcoRI, с 10-ти кратным избытком препарата фермента, далее анализируют электрофоретическое поведение суперспиральной молекулы ДНК.

Отсутствие экзонуклеаз и фосфатвз в препарате фермента определяют по эффективности лигирования линейной формы плазмиды

РВР— 322, полученной в результате действия на кольцевую. молекулу этой. ДНК исследуемым ферментом, имеющим один участок. узнавания на ДНК плазмиды PB R 322. Лигирование осуществляют с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4.

Препарат рестриктазы EcoRI, полученный предлагаемым способом, не содержит примеси

EcoRl активности, о чем свидетельствует полное отсутствие фрагментации ДНК фага лямбда в условиях, оптимальных для проявления EcoRI активности: в низкой ионной силе при щелочных значениях рН, когда фермент EcoRI не активен. Препарат фермента

EcoRI свободен даже от следовых неспецифических эндонуклеаз, о чем можно судить по полному сохранению суперспирализованной структуры репликативной формы ДНК фага

Х 174. Отсутствие неспецифических эндонуклеаз и фосфатаз. подтверждается высокоэффективным лигированием линейной молекулы ЛНК

PB 322 после расгцепления ее полученным н ферментом. Правильность восстановления кольцевой формы плазмидной ДНК подтверждается повторным гидролизом рестриктазои

EcoRI с образованием линейной формы, 5 1120019 б рН 4,2 — 4,5 обнаруживается пик активности

EcoRI, а пик .активности Есо Rl отсутствует.

Пример 2. Выращивание клеток, разрушение клеток, получение грубого экстракта и фракционирование на голубой сефарозе ве. дуг по примеру 1. Изоэлектрофокусирование фракций, содержащих активностью EcoRI, проводят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 3,5 — 10 в условиях грациента плотности глицерина 60 — 0,1%, Изоэлектрофокусирование ведут 16 ч при 600 V и затем 48 ч при

1000 V. Активность рестриктазы EcoRI присутствует вэ фракциях 21 — 25 градиента, что соответствует изоэлектрической точке белка

pl 785 Пик ак вности EcoRI обнаружи- !5 вается во фракциях 2 — 6, что соответствует изоэлектрической точке белка рl 4,35..

Пример 3. Выращивание и разрушение клеток, получение грубого экстракта и фракционирование на голубой сефарозе

20 ведут по примеру 1. Изоэлектрофокусирование фракций, содержащих активность EcoRI, проводят на колонке с амфолинами в диапазоне рН 3,5 — 10 в условиях градиента плотности глицерина 60 — 0,1% в течение 72 ч при 600 V.

В градиенте обнаруживаются размытые перекрывающиеся пики . EcoRI и EcoRI активности.

Для стандартной процедуры выделения фермента выбран пример 2. Фермент EcoRI, свободный от активности EcoRI обнаружи30 вается в пяти фракциях !8 — 22 градиента в диапазоне рН 7,0 — 8,0 в присутствии 20 o-ного глицерина.

Предлагаемый способ характеризуется тем, что изоэлектрофокусирование является единст- 35 венным методом, с помощью которого можно получить рестриктазу EcoRI, свободную от активности EcoRI . Предлагаемый способ позволяет за 6 дн. получить концентрированный фермент EcoRI с высоким выходом

30000 ед. активности на 1 r пасты, При традиционном способе получения рестриктазы

EcoRl из 1 г пасты за 9 — 10 дн. обработки выделяют 30000. ed. суммарной активности

EcoRI и EcoRI ферментов. Активность

EcoRI тестируется во фракциях, содержащих

20%-ный глицерин, что позволяет исключить стадию стабилизирующего диализа. Ферментный препарат хранится при -!Оо в течение 12 мес. без потери активности.

Активность фермента определяют в инкубационной смеси следующего состава: О,! М трис-НСI буфер рН 7, 4, 10 мм М С!

l мм р -меркаптоэтанола, мкг ДНК фага лямбда. Инкубациюведут при 37 С 1 ч. Реак- 5$ цию останавливают добавлением 5 мкл

50% ного глицерина с !00 мм ЭДТА и

0,5%-ного бромфенолового синего. Рестрик11 001

Составитель А. Макаров

Техред О.Неце Корректор А . Обручар

Редактор Н. Джуган

Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 8170

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образо1ч, предлагаемый препарат фермента может быть использован в эксперименте по генетической инженерии и структур. ных исследованиях. Полученный препарат фермента (специфическая эндонуклеаза рестрик- 5 ции EcoRI) превосходит лучшие образцы зарубежный коммерческих препаратов ферментов данного класса по очистке от рестриктазы Есор,а также по удельной активности и выходу фермента.

Таким образом, простота выделения 10 фермента (две стадии фракционирования на колонках вместо 3 — 5 обычных, минуя пред. варительное высаливание и освобождение от нуклеиновых кислот), уникальная чистота фермснта и высокая удельная активность позволяют более широко использовать этот фермент как уникальный инструмент в молекулярно-биологических, генно-инженерных и структурных исследованиях для выделения индивидуальных генов, промоторных. областей, маркерных зон; а также для получения рекомбинантных ДНК.