Конъюгаты тиреоидных гормонов с альбумином для выработки антител к тиреоидным гормонам у животных

 

КонЫогаты тиреоидных гормонов с альбумином формулы GO -IW - oMSyMUM lIH-CO-CHj где X: СН,- (Л для вьфаботки антител к тиреоидным СО гормонам у животных. 00

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф", с « фя рщ 1

СО -Жн — аьфжж

Х вЂ” Н

Mi — СО- СН

Ъ где Х:

СЯ,—

ГГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

re ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPbfTHA (21) 3536303/23-04

« (22) 10.01.83 (46) 15.04.88. Бюл. В 14 (71) Институт биологической химии

АН БССР (72) В.Д.Матвеенцев, О.В.Свиридов, О.А.Стрельченок и А.А.Ахрем (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Резников А.Г. Методы определения гормонов. Киев. "Наукова думка", 1980, 182.

Ultan Е.F., Yoshida R.À., Blakemore J.I., Moggio Е., Leute В.

Mechanism of inhibition of malate

dehydiogenase by thyvokine derivatives and reactivation by antibodies

ВхосЬеш Biophys Acta, 1979, 567, 66-74.

Garrett Е.R. Suzuki Т., Meber D;J.

The acidic solvolytic tiansformations.

of an iodinated nucleoside the antiviral 5-iodo-2 -deoxyuridine J.Amer. .СЬев. Soc. 1964, 86, 4460. (54) КОНЬ10ГАТЫ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ

С АЛЬБУМИНОМ ДЛЯ ВЫРАБОТКИ АНТИТЕЛ

К ТИРЕОЦЦНЬМ ГОРМОНАМ У ЖИВОТНЫХ

„„SU„„11 19 1 (53)4 С 07 К 15/06 А 61 К 37/02 (57) Коньвгаты тиреоидных гормонов с альбумнном формулы для выработки антител к тиреоидным гормонам у зивотных.!!2193!

10 где Х;

20 сн —

СΠ— ОСН, 1

Х вЂ” сн

ИН- СΠ— а)ьЮуюии

СООН COOM ! I дцгк -ЛЮЛ

Х вЂ” СН + СН вЂ” СО- 0-N X СЕ

Ъ !

Mt 2

О

ЯН вЂ” СО-СН î - m — альфиин

X — СН ! ян- со- сн

МН вЂ” Со-СН

Изобретение относится к новым биологически активным соединениям— конъюгатам тиреоидных, гормонов с альбумином общей формулы

СΠ— 74H и Мою

Х вЂ” СН I

ЗН вЂ” СΠ— СН для выработки антител к тиреоидным гормонам у животных.

Известны аналоги описываемых соединений:конъюгаты формул ТТ и III соответственно

0 °

CO — ОМ ж

Х-СН 0

Пример 1. Получение конъюга5 та М-ацетилтироксина с альбумином.

Растворяют 50 мг (64 мкмоль) тироксина в 15 мл этилового спирта и добавляют 30 мг (190 мкмоль) N-оксисукСΠ— OCM з

X — СН CR

Ш

) Ь °

-ъ)Н вЂ” Со- Сяд И- сН Со-ЗН-юйЬа

Конъюгаты формулы II имеют низкую степень конъюгирования (11-1 молекул тиреоидного гормона на 1 молекулу альбумина), что приводит к недостаточно эффективной наработке антител. Кроме того, при получении II и III на 1-й стадии может происходить частичное деиодирование исходного соединения, что приводит к образованию в конъюгате тироксина с альбумином примеси трииодтиронина с альбумином. В связи с этим известные конъюгаты II и Ш не могут обеспечить выработку высокоспецифических антител.

Цель изобретения - новые конъюгаты тиреоидных гормонов с альбумином с высокой степенью конъюгирования и обеспечивающие выработку антител к тиреоидным гормонам с высокой специфичнос тью

Поставленная цель достигается описываемыми конъюгатами тиреоидных гормонов с альбумином общей формулы

1 для выработки антител к тиреоидным гормонам у животных.

Конъюгаты получают по следующей схеме цинимидного эфира уксусной кислоты.

Перемешивают 20 ч при комнатной температуре, рН 8,5. Этиловый спирт упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 НС1, 1121931 водой, высушивают На 804, упаривают в вакууме. Получают 50 мг (95X) аморфного N- àöåòèëòèðîêñèíà.

Растворяют 50 мг (61 мкмоль) N-аце-

5 тилтироксина в 4 мл этилацетата, добавляют 1О мг (87 мкмоль) N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до О С и по каплям добавляют 14 мг (67 мкмоль) дициклогексилкарбодиимида в 2 мл этилацетата. Перемешивают 1 ч при

О С и 20 ч при комнатной температуре.

Выпавшую днциклогексилмочевину отфильтровывают, этилацетатный раствор промывают последовательно в 1 H NaHCO>, водой, высушивают На 30, упаривают в вакууме. Получают 50 мг (90X) N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтироксина. Т.пл. 188-189 С (этилацетат/гек сан) . 20

ИК-спектр, см : 1680, 1748, 1795, 1825, 3400.

М.вес.916,0 Cq(H(gO N Ig

Найдено,X: С 27,53; Н 1,68; N 3,01

Вычислено,X: С 27,51; Н 1,75; 25

К 3,06.

Растворяют 50 мг (64,2 мкмоль) Nоксисукцинимидного эфира N-ацетил-: тироксина в 5 мл диоксана и прибавля- 30 ют 50 мг (0,72 мкмоль) бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 5 мл воды (рН 8,35; 0,1 М р-р NaHCO>). Перемешивают в течение 20 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 36 ч, лиофилизуют. Определение степени конъюгироваиия тиреоидного гаптена с БСА проводят спектрофотометрическим методом. Для этого измеряют поглоще- ние конъюгата в области 300, нм, обусловленное в основном поглощением гаптена и вычитают вклад поглощения бел. ка в эту спектральну область На ос- 45 новании предварительно найденного коэффициента экстинкции тиреоидного гаптена рассчитывают концентрацию гаптена в растворе и .относят ее к Hsвестной концентрации белка. Для про- 5В верки достоверности расчета. степени конъюгирования с БСА были использованы радиоактивномеченные гаптены с известной удельной радиоактивностью..

Разница в определении но двум методам не превышала -8X. По данныи

:спектрометрических измерений на 1 молекулу БСА приходится 48. молекул Nацетилтироксина.

П р и м e p II. Получение конъюгата N-ацетилтрийодтиронина с альбумином, Растворяют 250 мг (0,406 мкмоль) трийодтиронина в 60 мл этилового спирта и добавляют 78,5 мг (0.5 мкмоль)

N-оксисукцинимидного эфира уксусной кислоты. Проведение реакции и выделение продукта, как в примере l. Иолу-: чают 250 мг (94X) аморфного N-ацетилтрийодтиронина.

Растворяют 250 мг (0,360 мкмоль)

N-ацетилтрийодтиронина в 10 мл этилацетата, добавляют 57,5 мг (0,5мкмоль

N-оксисукцинимида. Раствор охлаждают до.О С и по каплям добавляют 84,2 мг (0,4 мкмоль) дициклогексилкарбодиимида в 4 мп зтилацетата. Проведение реакции и выделение продукта, как в примере 1. Получают 250 мг (87,7X)

И-оксисукцинимидного эфира.N-ацетилтрийодтиронина. Т.пл. 152-154 С абс. этиловый спирт.

ИК-спектр, см : 1670, 1748, 1795, 1825, 3400.

М.вес. 790,01 С2 Н1ч Оч N

Найдено,X: С 31,87; Н 2,07;

И 3,51.

Вычислено,X: С 31,90; Н 2,15;

N 3,54.

Растворяют 50 мг (76,2 мкмоль) Nокснсукцинимидного эфира N-ацетилтрийодтиронина в 5 мл диоксана и прибавляют 50 мп (0,72 мкмоль) БСА в

5 мп 0,1 М раствора NaHCO, рН 8,35.

Условия проведения реакции и выделения целевого продукта описаны в при- . мере 1.

По данным спектрофотометрии на 1 молекулу БСА приходится 46 молекул

N-ацетилтрийодтиронииа.

Проведены биологические испытания описываемых конъюгатов общей формулы

I. Для сравнения взяты известные конъюгаты общей формулы II — лучшие из применяемых для радиоиммунологического анализа тиреоидных гормонов.

В ходе испытаний определялись иммуногенные свойства конъюгатов тиреоидных гормонов с альбумином, т.е. способность описываемых соединений вызывать при введении в организм живого образование эа определенный промежуток времени антител к тиреоидным гормонам и изучались характеристики полученных антител.

Иммунизация кроликов конъюг атом

К-ацетилтироксина с альбумином.

5 112193!

Конъюгат (1 мг), содержащий 48 мо- лекул. тироксина на молекулу альбумина, растворяли в 0,5 мл физиологического раствора и прибавляли 0,5 мл

5 полного адъюванта Фрейнда. Смесь тщательно гомогенизировали и с помощью медицинского шприца вводили кролику, Процесс иммунизации состоял нз нескольких циклов. Первый цикл 1О включал трехкратное введение конъюгата подкожно во множество точек спины животного. Второй и последующие циклы состояли из однократного введения антигенного материала в той же дозе, 15 что и в первом цикле. Взятие крови для тестирования антител проводили на 8-10 день после введения конъюгата. После дефибринирования и отделения форменных элементов крови получали сыворотку, содержащую антитела к тироксину (антисыворотку).

Иммунизация кроликов конъюгатом

Я-ацетилтрийодтиронина с альбумином.

Антисыворотку к трийодтиронину но- 2б лучали как описано выше, но вместо конъюгата тироксина с альбумином использовали конъюгат трийодтиронина с альбумином, имеющий 46 молекул трийодтиронина на молекулу альбумина. 30

Определение характеристик полученных антител.

С помощью стандартных методик определялись следующие характеристики антител: титр - (величина, характеризующая концентрацию антител в сыво- . ротке .и определяемая наибольшим разведением антисыворотки, при котором связывается 50Х меченого антигена); специ4жчность - (относительная реакцион- 40 ная способность тироксиновых антител к трийодтиронину и трийодтирониновых антител к тироксину).

Нашли, что уже через месяц после. начала иммунизации достигается активность антител, достаточная для целей радноиммунного определения тироксина и трийодтиронина. После второго цикла иммунизации достигались титры 1

15.000 и 1:12.000 для тироксиновых и трийодтирониновых антител соответственно.

При использовании известных конъюгатов формулы II максимальный титр тироксиновых антител составлял

1:4.000, а трнйодтирониновых — 1:

:2.000. I

Относительная реакционная способность тироксиновых антител к трийодтиронину составила 0,8Х, а относи20 тельная реакционная способность трийодтирониновых антител к тироксину—

0 02Х. Для конъюгата II эти величины равны 2-3Х и 0,2-0,4Х соответственно.

Проведенные испытания позволяют сделать вывод, что иммунизацию животных описываемыми соединениями l уменьшает время образования антител (усиливает динамику их продуцирования) и увеличивает значение их максимальной концентрации (ТИТР) по сравнению с. аналогичными соединениями (II). Получаемые антитела обладают высокой степенью конъюгирования (46-48 вместо !

1-16 для II) и специфичностью и могут использоваться для радиоиммуиологического опредепения тироксина или трнйодтиронина. Описываемые конъюгаты могут быть использованы для наработки высокоспецифических антител, являющихся компонентом радиодиагностических наборов для определения тироксина и трийодтиронина.

Ссй тави тела

Редактор Н.Сильнягина Техред Л.Сердюкова Корректор В.Бутяга

Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5, Заказ 3372 производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4