Способ удаления белков из водных растворов
СПОСОБ УДАЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ ВОДНЫХ РАСТВОЮВ, включающий адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве сорбента используют гидрофильный аэросил, а адсорбцию проводят при рН 1-5,6.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕОЪЬЛИН
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР (21) 3610672/28 — 13 (22) 26.04.83 (46) 07.11.84. Бюл. У 41 (72) Н. Б. Луцюк, П. К. Загниборода, М, Ф. Кулик, Г. П. Богачук, Г. В. Терентьев и Д. Д. Буткалюк (71) Винницкий медицинский институт им. Н. И. Пирогова (53) 577.15 (088.8) (56) 1. Практикум по биохимии, Под ред. С. Е. Северина. М., МГУ, 1979, с. 89.
2. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. Под ред. Т.Т. Березова, М., "Медицина", 1976, с. 139. (54) (57) СПОСОБ УДАЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ
ВОДНЫХ РАСТВОРОВ, включающий адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, о т л ичающийся тем,что, сцельюупрощения и ускорения процесса, в качестве сорбента испбльзуют гидрофильный аэросил, а адсорбцию проводят при рН 1-5 6.
В табл. 3 приведены данные о влиянии рН на эффективность депротеинизации.
Адсорбция белка аэросилом А — 300 в значительной степени зависит от рН раствора.
При рН 5,6 и ниже из сыворотки крови, содержащей большое количество различных по своим физико-химическим свойствам белков, аэросилом удаляются все без остатка белки. Альбумин полностью адсорбируется при рН 6,2 и ниже. При сдвиге, рН в щелочную сторону адсорбция белков аэросилом уменьшается. Аналогичные результаты получены при определении белка по методу Лоури.
Примерно равную адсорбционную способность по отношению к белкам в водной среде проявляют другие марки аэросила (А — 175, А — 380), в связи с чем их депротеи1 11223
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для удаления белков, ферментов, антигенов и антител, токсинов и других биологически активных веществ белковой природы из водных растворов.
Известны способы удаления белков иэ вод иых растворов, основаннь!е на осаждении белков нагреванием или обработкой кислотами (11. !О
Недостатки удаления белков обработкой кислотами заключаются в загрязнении безбелкового фильтрата агрессивными в химическом отношении веществами. Кипячение непригодно для депротеинизации разбавленных растворов.
Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ удаления белков из водных растворов, включающий адсорбцию белков на сорбенте, в качестве которого используют гидроокись цинка, и отделение депротеинизированного раствора фильтрацией (2) .
Однако известный способ сложен и длителен, так как необходимо перед удалением белков получать сорбент путем смешивания сернокислого цинка с щелочью и последующего кипячения и фильтрования. Сама депротеинизация также включает стадию термообработки. Депротеинизированные растворы загрязняются ионами тяжелого металла— цинка.
Целью изобретения является упрощение и, ускорение процесса удаления белков из водных растворов, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу удаления белков из водных растворов, включающему адсорбцию белков на сорбенте и отделение депротеинизированного раствора фильтрованием, в качестве сорбента используют гидрофильный аэросил, а адсорбцию проводят при рН 1-5 6.
Предлагаемый способ заключается в том, что в качестве сорбента используется гидрофильный аэросил, обладающий способностью адсорбировать белки, не адсорбируя при этом
45 декстраны, гепарин, хлорофос, органические и неорганические кислоты. Адсорбция аэросилом белков протекает значительно более эффективно, чем адсорбция щелочей, ацетона и аминокислот (табл. 1). Депротеинизацию следует проводить при рН среды 1
5,6, так как дальнейшее увеличение рН приводит к снижению эффективности сорбции белков на аэросиле. Аэросил депротеинизирует водные растворы практически мгновенно 55 (необнаружено существенной разницы в депротеинизирующем действии при контакте АС с раствором белка в течение 1 и 10 мин).
54 ъ
Для депротеинизации могут быть использованы различные типы гидрофильных аэросилов (например, А — 300 и А — 175), с удельной поверхностью соответственно 300 и 175 м /г), Для полного удаления белка из водных растворов требуется добавлять не менее 1 г аэросила А — 300 на каждые 160 мг белка. С учетом специфичности адсорбирующего действия аэросила предлагаемый способ может быть с наибольшей эффективностью использован для удаления белков из растворов, содержащих полисахариды, хлорофос, гепарин и органические кислоты. Преимущества способа заключа. ются в его простоте и быстром протекании депротеиниэации.
Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.
Пример 1. В пробирку наливают
9,8 мл физраствора (рН 5,6) и 0,2 мл лошадиной сыворотки, вносят 100 мг аэросила А-300. Содержимое пробирки встряхивают и фильтруют через бумажный фильтр.
В фильтрате определяют наличие белка пробой с сульфосалициловой кислотой (ССК), для чего к 2 мл фильтрата добавляют 4 капли 20%-ного раствора ССК. Весь белок из
0,2 мл лошадиной сыворотки (около
16 мг) адсорбируется на 100 мг аэросила
А — 300. В табл. 2 приведены данные по депротеинизации, водных растворов, содержащих разные количества сыворотки. В описанных условиях опыта 100 мг аэросила A — 300 способны адсорбировать на себе весь белок, содержащийся в 0,2 мл сыворотки, т. е. около 16 мг белка (16% от веса препарата).
Такие же данные были получены при использовании в качестве источника белка аптечного препарата "Инсулин для инъекций".
Для полного удаления белка к 5 мл преларата оказалось необходимо добавить 300 мг аэросила А — 300.
Таблица 1
Метод определения
Вещество
Белки (кристаллический альбумин, 6 ферментов, сыворотка крови, пищеварительные соки) Формоловое титрование
Титрование щелочью
8 аминокислот
15-70
Органические и неорганические кислоты (уксусная, щавелевая, соляная, серная) Шелочи (NaOH,КОН)
Ацетон
Хлорофос
23
Декстран(полиглюкин) Интерферометрия
То же
Гепарин (кристаллический препарат, растворенный в физрастворе) 3 11223 ниэирующее действие можно считать закономерным свойством всех марок гидрофильного аэросила.
Пример 2. Для доказательства полной депротеиниэации водных сред аэросилом использован также наиболее чувствительный метод — ферментативный. Исчезновенйе ферментативной активности после обработки аэросилом является доказательством депротеинизации. В качестве источников ферментов использованы кровь (фермент каталаза), слюна (фермент амилаза), аптечный препарат пепсина, экстракт поджелудочной железы свиней и крупного рогатого скота (трипсин).
Во всех случаях добавление аэросила прнво15 дит к полному исчезновению ферментативной активности иэ анализируемых растворов. Для полной депротеиниэации достаточно добавить к растворам следующие количества аэросила
А — 300: на 10 мл разведенной в 1000 раэ 20 крови — 100 мг аэросила (удаление катала54 зы); на 10 мл разведенной в 4 раза слюны
200 мг аэросила (удаление амилазы); на
10 мл 0,1%-ного раствора пепсина-200 мг аэросила; íà 10 мл водной вытяжки поджелудочной железы свиней или крупного рогатого скота, а также на 10 мл химуса тонкого кишечника 250 мг аэросила (для ударения амилазы и трипсина) .
Таким образом, использование предлагаемого способа депротеиниэации позволяет значительно упростить удаление белка, исключив стадии подготовки сорбента и кипячения белковых растворов. Быстрое связывание белков с аэросилом (в течение 1 мин), а также исключение ряда стадий, позволяет значительно ускорить депротеиниэацию. Способ не требует специального оборудования. Высокая химическая частота аэросилов, а также их нерастворимость позволяют получить депротеиниэированные водные растворы, несодержащие химически агрессивных соединений.
Осаждение сульфосалициловой кислотой, спектрофотометрия, метод Лоури
Титрование кислотой
Реакция с нитропруссидом
Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином
1122354
Таблица 2
Ингредиенты
Пробирки
1 Г,!
Физраствор, мл !
9,9 10 10
Сыворотка, мл
0,1
100 100 100 100 100
100
100 100
++ ++ ++
П р и м е ч а н и е (к табл. 2 и 3):
++ — отчетливая немедленная реакция на белок;
+ — слабая немедленная реакция на белок; . «+ — слабая реакция на белок спустя 1 ч после добавления ССК; — отрицательная реакция на белок спустя 1 ч после добавления ССК.
Таблица 3
Пробирки
I 2 3 4 5 б 7 8 9 10 ll 12.13 14 15
Ю Ю 1О Ю 1О Ю ЮЮЮ
0,2 о,2 о 2 о,г о,2 о,г 0,2 о 2
Пошадииал сыворотка, мл 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 7,0
Физиологический раствор, мл
l0 Ю
Ю Ю Ю 1О рИ (доведеио щелочью или соланой кислотой) 8 9
1 2 3 4
100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Аэросил h-300, sa
lHpo6s на белок с сульфа-Отри- Отри- Отри- Отри. Отри- Отри. Отрисалициловой ки слотой цатель. ца- датель-ца- датель. as. цатель(сск) . иал тель- нал тель ass тель- ная н н н н н
+ +
Тоже ТожеТоже Томе Томе Томе Тоже Отри. Отрица- датель. тель
+ e+ ++ ++ ++ тель,То же Тоже Тоже Томе Тоже Тоже Тоже
П р и и е ч а н и е: при рК 8 и 9 и выше не только белок, ыо и взвесь аэросила проходит через фильтр.
Составитель В. Муронец
Техред З.Палий Корректор В. Гирняк
Редактор Л. Гратилло
Заказ 8062/6
Тираж 532 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Аэросил, мг
Проба с ССК
То we, ио вместо сыворотки взлто по 0,2 мл
8%-мого раствора алъбумииа (проба с ССК) 9,0 9,3 9,5
1,0 0,7 0,5
9,7 9,8
0,3 ОД
+ Отрица- Отрица- Отрица- Отрицательная тельная" тельная тельная»
