Штамм перевиваемых клеток @ -кд,используемый для вирусологических исследований

 

Штамм перевиваемых клеток HeLa-КД № 11083 (коллекция клеточных .культур Свердловского научно-исследовательского института вирусных инфекций), используемый для вирусологических исследований.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„,.ЯО„„3 122692

ВСЮ С 12 N 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И.ОТНРЫТИЙ (21) 3645207/28-13 (22) 20.09.83 (46) 07.11.84. H . e 41 (72) Н.П. Глинских, Ф.Я. Зусман, С.Г. Курумчнна и В.П. Устьянцев (7 1) Свердловский научно-исследовательский институт вирусных инфекций (53) д 6 16-07(088.8) (56) 1. J. Сапсег Res., 1952, 12, р.. 264 . (54) ШТАИИ ПЕРЕВИВАЕИЫХ КЛЕТОК

HELA-КД, ИСПОЛЬЗУЕМЫИ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. (57) Штамм перевиваемых клеток

HeLa-КД - 11083 (коллекция клеточных .культур Свердловского научно-исследовательского института вирусных инфектдй), используемый для вирусологических исследований.

1 11226

Изобретение относится к медицинс кой вирусологии и представляет собой клоновьп» вариант клеток эпидермоидной карциномы шейки матки человека для вирусологических исследо5 ваний.

Известен штамм перевиваемых клеток HeLa> происходящий от клеток эпидермоидной карциномы шейки матки человека (1) .

Однако этот штамм, в силу того, что его культивировали в различных лабораториях при .различных режимах и .в различных по составу питатсльных средах, стал вариабельным по . культуральной, морфологической, вирусологической и кариотипической характеристикам.

Целью изобретения является отбор штамма перевиваемых клеток НеЬа, отличающийся стабильностью своих культуральных, морфологических, вирусологических и.кариотипических характеристик.

Эта цель достигается использованием штамма HeLa-КД, представляющего собой клоновый вариант клеток эпидермоидной карциномь1 шейки матки человека.

Штамм НеЬа-КД получен путем одно.

30 кратного. клонирования линии клеток эпидермоидной карциономы шейки матки человека по Паху и последующего двукратного клонирования по У Миню в модификации Угрюмова, хранится в коллекции клеточных культур

Свердловского HHFFBH под 110-13.

Морфологические признаки. Попу— ляция клеток HeLa-КД характеризуется однородными клетками полигональной формы с отчетливыми светлыми границами, мелкозернистой цитоплаз- . мой и свально-круглым ядром с 2-4 мелкими ядрьппками неправильной формы.

Культура в своем составе имеет незначительную долю аномальных интерфазных клеток 0,7 + +0,3% и аберрантных форм митоза 3,8 + 0,5%, характерньп» для клоновой линии клеток HeLa-КД является ограничение полиплоидности с четким выделением модального клас- 50 са: 50,2 «+ 1,8% клеток содержат 6165 хромосом. физиологические признаки. Клетки

HeLa-КД снимают со стекла раствором

Версена щадящим способом, без центри- 5 фугирования, ресуспендируют и рассевают в культуральные матрасы 8 дозе

50 тыс./мл или в пробирки по

92 2

120 тыс./мл. Пересевы осуществляют через 5-6 дн роста. Среда роста состоит из равных обьемов среды 199 и среды Игла с добавлением 10% нативной сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота и антибиотиков (пепициллин 100 ед/мл, стептомицин

50 ед/мл, рН 7,2-7,4.

Клоновая линия HeLa-КД отличается стабильной и более выраженной чувствительностью к респираторным и энтеральным вирусам (полио-, ECHO, Коксаки). Цитопатический эффект под влиянием аденовирусов проявлялся в виде набухания.и округления клеток с образованием гроздьевидных скоплений клеток. Начиная с 24 ч после заражения размеры ядер и ядрышек увеличиваются, в ядрах появляются базофнльные пикнотические включения, которые постепенно заполняют все ядро. Процесс perer»eparrrrr». клеток HeLa-КД под воздействием аденовируса:заканчивается в течение

48-72 ч. Данные иммунофлуоресцентного анализа выявили максимальное накопление вирусснецифического антигена через 36-48 ч. Титр аденовируса в зараженной культуре 4,55,33 Ig ТЦЦ .. Инфицирование клеток HeLa-КД респираторно-синцитиальным вирусом штамма Лонг вызывает образование симпластов через 2436 ч, Полная деструкция монослоя наступает через 72-96 ч после внесения вируса. Инфекционный титр вируса составляет 4,5-5,5 Ig ТПД О/ог о о,г „.

Содержание вирусного антигена в зара. женных клетках соответствует инфекционному титру вируса.

Инфекционный титр вирусов Коксаки В1, ВЗ, В5 на клетках .HeLa-КД составляет 4,5-5,75 Ig ПЩ@ Н(а,гмз поливирусов I II u III типов 5,57,0 Ig ТЦЦЮ мА

Данная клеточная культура может быть использована при необходимости выделения вирусов из материалов от больных при диагностике вирусных инфекций.

Для культивирования клеток исполь зуется смесь равных количеств среды

199 и среды Игла с 10% нативной сыворотки крови молодняка крупного рогатого скота. Доза клеток при посеве в культуральные матрасы составляет 50 тыс./мл, в пробирки120 тыс./мл. Пересев осуществляют через 5-7 сут роста.

2692 . 4 вую среду с 10% стерильного глицерина. Запаянные ампулы выдерживают в течение 2-3 ч в рефрижераторе, затем замораживают с помощью аппарата AXK-4 со скоростью 0,5 С/мин о от 0 до -20 С, 4 С/мин до -40 С, 10 С/мин до -80 С, с последующим о о погружением в сосуды Дьюара с жидким азотом.

Режим восстановления: ампулы с клетками после извлечения из азота помещают в водяную баню с температурой +38 С. Размороженные клет0 ки тотчас помещают в культуральные

15 матрасы объемом 250 мл в 30 мл среды роста с 10% сыворотки. Со 2-3 пассажа клетки приобретают способность формировать плотный монослой.

Культура может быть использова20 на в вирусологическпх исследовани. ях и при выделении вирусов из ма-. териалов больных в диагностической вирусологии.

3 112

В табл..1 даны результаты использования клоновой линии перевиваемых клеток HeLa-КД для получения антигенов вирусов; в табл. 2 — то же, для изучения репродукции аденовируса типа 7 ин витро в табл. 3 то же, для изучения репродукции респираторно-синцитиального вируса штамма Лонг, в табл. 4 — то же, для оценки динамики накопления специфического антигена в клетках (в процентах) по данным иммунофлуоресцентного анализа; в табл, 5 то же, для изучения некоторых показателей матотического режима попу-. ляции на примере аценовируса типа 7 (доза заражения 0,1 ТПД 7ц„),.

Клетки HeLa-КД хранят в замороженном состоянии.

Режим замораживания: клетки разливают по ампулам в концентрации

1-3 млн, в 1 мл. В качестве консервирующей среды используют ростоТаблица 1

Титр вируса, Ic ТПД-О ., по пассажам

УОИ, 7 ллл

Вирус

I тТ IП

4,5 + 0,5

4,5 + 0;5

4,5 + 0,5

4,0+ 0,5

5,5 0,5

6,0+ 0,5

5,5+ 0,5

4,5 + 0,5

4,5+05

4,0. + 0,5

5,0 + 0,5

5,5 + 0,5

5,5 + 0,5

4,0+ 0,5

4,0+ 0,5

+ 0,5

«+ 0,5

+ 0,5

+ 0,5

+ 0,5

+ 0,5

4,5

6,0

5,75

5,5

4,5

5,0

Таблица 2

Характер дегенерации : Чистота вирусной и время популяции

Титр вируса, ПДРО/ОД мь

Клеточная культура

5,33 + 0,5

Специфический через 48-72 ч

Более 95% полных вирус ньтх частиц !

НеЬа-исходная

3,5 «+ 0,5

С элементами неспецифики за счет.раннего подползания монослоя 36-72 ч

Аденовирус типа 7

Респираторно-синцитиальный (штамм Лонг)

Полно I

Полио II

Полио III

Коксаки В1

Коксаки ВЗ

Присутствие во взвеси до 1 0% частиц микоплазм

))22692

Т а б л и ц а 3

Титр вируса, Ig ТЦД Характер дегенера т"0 0,2 м ции

Клеточная культура

4,5+0,5

Специфическая через

72-96 ч

HeLà-КД

3,0 «+ 0,5

НеЬа-исходная

С элементами неспецифики за счет более раннего подползания монослоя через 4872 ч

Таблица 4

Респираторно-синцитиальный вирус (штамм Лонг) Аденовирус типа 7

Время после заражежения, ч

HeLe-КЦ

HeLa-исходная

8eLa-КД

HeLa исходная

5,0 + 1,3

3,5 - - 1,4

4,6 .- l,2

5,6 + 1,8

18,0 z 2,6

8-12

15+ 0,8

20,3 + 3,0

45 « - 2,8

18-24

36-48

18,3 2,8

26эО + ЗэО

36,2 «+ 2,5

41,0 3,5

Таблица 5

Число.клеток с аноВремя Митотическая после активностьэ зараже- Ж ч мал ьными формами интерфазно ного ядра, 70

Анафаза

Метафаза

Телофаза

11,8+2,7 0,4+0,55

28 6,3

1,2+1 1

38 «+ 5,2

2,4+1,65

47 + 4,4

17 э2+4 э1

52 «+ +6,0

27,4+3,7

0,4+0,55

64+52

34,0+7,2 0,8+0,55

34 э4«+8 э5 0 э4+О э 55

36, 2+6, 7 0,8+О, 5

82+ 7,0

16

78+ 6,8

0,4+0,55

Число аномальных форм митоза, Х от общего числа делящихся клеток, по фазам

12,6+3, 1 1, 2+0,55 0,4+О, 55

16эЗ+3,0

8,0+Оэ8

7,0 0,8

6,0+0,4

И,о+1, 7

12, О+0,8

7,0+1, 2

1122692

Продолжение табл.5 о аномалънык форм митоэа, общего числа делящихся клеток, по фазам

Жтотическая активностьэ

X тафаэа

Акафаэа

Контроль 58 + 2,522,6+2,1 - 1,0+0,55 — 2,0+0,55

5,0+2,624,0+2,3 0,8+0,55 2,4+0,55

1-24

53. + 2,3

5,5+2,3

П р и м е ч а н и е; Исходная линия клеток НеЬа для изучения показателей митотического режима является непригодной из-за выраженной патологии интерфазных и делящихся клеток.

Составитель А. Маныкин

Редактор И. Николайчук Техред T.Ôàíòà Корректор М. Леонтюк

Заказ 8100/23 . Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР. по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раувская наб., д. 4/5

Время

Йосле эараже ч

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Число клеток с &но» калъныаи фориавею интерфаэно— ного ядра, Х