Штамм перевиваемых клеток @ -2- @ ,используемый для вирусологических исследований

 

Штамм перевивае вдс клеток НЕр-21Щ № 5983 (коллекция клеточных культур Свердловского научно-исследовательского института вирусных инфекций), используемый для вирусо .логических исследований..

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

Ф Ю

РЕСПУБЛИК

3(59 12 И

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ н втоииоММ СЕ ДителЫтау

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОЬРЕТЕНИИ И ОТНРЫТИЙ (21) 3645982/28-13 (22) 27.09.83. (46) 07.11.84. Бюл. Ф 41 (72) Н.П. Глинских, Ф.Я. Зусман, В.П. Устьянцев., С.Ф. Закирова, О.Ю. Козьмина, Л.В. Власова, А.Г. Сергеев и И,Г. Трофимова (71) Свердловский научно-исследовательский институт вирусных инфекций (53) 616-67(088.8) (56) 1. J. Cancer Res., 1955, 15, р. 598.

„.SU.„1122693 A (54) йГАЙИ ПЕРЕВИВАЕИЫХ KJIETOK нер-2-кД, использупюй ДлЯ вигусолоГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ. (57) Штамм перевиваемах клеток

НЕр-2КД В 5983 (коллекция клеточных культур Свердловского научно-исследовательского института вирусных инфекций), исиользуемый для вирусо,логических исследований., 1 1

Изобретение относится к медицинс кой вирусологии и представляет собой"клоновый вариант клеток эпидермоидной карциномы гортани человека.

Известен штамм перевиваещас клеток Нер-2, происходящий от клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (1)

Однако этот штамм в силу того, что его культивировали в различных лабораториях при различных режимах и в различных по составу питательных средах, стал нестабильным по культуральной, монологической и цитогенетической характеристикам и чувствительности к вирусам.

Целью изобретения является штамм перевиваемых клеток Нер-2, обладающий стабильностью своих культуральных, морфологических и цитогенетических характеристик и определенным спектром чувствительности.к вирусам.

Эта цель достигается с исцользованнем штамма НЕр-2-КД, представляющего собой клоновый вариант клеток эпидермоидной карциномы гортани человека.

Штамм НЕр-2-КД получен путем многократйого клонирования линии клеток эпидермоидной карциномы гортани человека но Паку и последующего двукратного клонирования по

У Ииню в модификации Угрюмова, хранится в коллекции клеточных культур

Свердловского НИИВИ под Н 5983.

Иорфологические признаки. Культура клеток НЕр-2-КД представлена крупными полигональными клетками с округлым ядром, содержащим 2-4 ядрышка. Популяция характеризуется однородностью своих составляющих: число клеток с ядрами неправильной формы не превышает 8-103 и не более 107. клеток имеют аномальные формы митотического аппарата. Кариотипическая характеристика клеток

НЕр-2-КД выражается в вариациях числа хромосом в клетках в пределах

54-68, при этом более 453 клеток составляют моцальный класс с 61-65 хромосомами.

Физиологические признаки. Клетки НЕр-2-КД снимают со стекла

0,02Х-ным раствором Версена щадящим способом, без центрифугирования, ресуспензируют и рассеивают в матрасы в лозе 30-50 тыс./мп нли. в пробирки в дозе 100-120 тыс./мл. Пересевы

122693 2

5 !

О

50 осуществляют через 6-7 сут роста.

Среда роста состоит из смеси равных объемов среды 199 и среды Игла с добавлением 107 нативиой, отконтролированной в отношении микоплазм сыворотки крупного рогатого скота, В среду роста добавдяют антибиотики: пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин

50 ед/мл, рН среды роста в пределах .

7,2-7,4.

Клоновая линия НЕр-2-КД характеризуется выраженной стабильной чувствительностью к вирусам: аденовирусы до 6,5 ед ТЦЦ 0 „, респираторно-синцитиальный (штамм doug) до 6,0 Хр, ТЦД5О „щ, ECHO до 5,0 Eg ТИЛ о мьь полновирусы (1, 2, 3 типы) до 7,5 ?8

Тип 5OINAП р н м .е р 1. Использование клоновой линии перевиваемых клеток

НЕр-2-КД как производственной культуры в работе с энтеровирусами.

В процессе разработки эритроцитарного группоспецифического диагностикума Коксаки В был испытан ряд различных клеточных культур, в частности НЕр-2-КД, RH, Чего, ПЗИ и

ИК-2, с целью выбора оптимальной для дальнейшего ее использования в качестве производственной культуры.

Опыты показали, что в отличие. от культур ПЗИ, NK-2 и Vего (почки обезьян} клеточные культуры НЕр-2-КД и КН позволяют получать вирусные антнгены с высокой не только инфек-: ционной, но и сенсибилизирующей активностью. Однако в отличие от куль- туры RH клоновая линия НЕр-2-КД имеет преимущества: стабильность культуральных и морфологических признаков в течение длительного времени, неприхотливость к используемым питательным средам и вследствие этого- большую доступность для использования, а также более выраженную чувствительность к вирусам Коксаки В.

В табл. 1 дана характеристика инфекционной и сенсибилизирующей активности антигенов вирусов Коксаки В, полученных в культуре НЕр-2-КД по данным многократных (до 14 повторностей} опытов.

В настоящее время клоновая линия перевиваемых клеток НЕр-2-ХД используется для получения экспериментально-производственных серий эритроцитарного группоспецифического диагностикума Коксаки В °

3 11

Учитывая доступность и высокую чувствительность клеток НЕр-2-КД к вирусам энтеральной группы, в частности к вирусам. полиомиелита 1,2 и 3 типов и к вирусам Каксаки группы В, эта культура является незаменимой при получении антигенов для иммунизации кроликов и крыс с целью получения специфических иммунных сывороток. В течение 1982-83. гг. было использовано более 600 голов лабораторных животных, что нозволило.поМучйть несколько литров -иммунной сыворотки, используемой для раз-. личнык экспериментальных целей. Кроме того, эта культура -постоянно используется для индикации. и идентификации вирусов, выделенных иэ ма, териалов от больных вирусными заболеваниями.

Пример 2. Использование клоновой линии перевиваемих клеток .HRp-2-Kg для диагностики вирусных инфекций.

В практическом здравоохранении при постановке клинического диагноза "полиомиелит", "полиоииелитоподобное заболевание", "энтеровирусная инфекция, спинальная форма", "спинальный парез неясной этиологии" и других, возникает необходимость проведения вирусологического обследования больных в сопоставлении с даннымн серологического обследования. С использованием клеток

НЕр-2-КД в лаборатории энтеровирусных инфекций СНИИВИ было обследовано более 1100 больных с укаэанными диагноэами. Серологический диагноз полиовирусной инфекции был подтверж. ден у 8,5-26Х по разным группам обследования. Выделяемость энтеровирусов по этим группам составляла

3,2-26Х.

Использование клоновой линии клеток НЕр-2-КД при обследовании здоровых детей позволяет определять уровень напряженности иммунитета у привитых.

П,р н м е р 3. Культура Нер-2 устойчива к длительному анабиотическому состоянию при субоптимальных температурах в процессе транспортировки на дальнее расстояние. В качестве примера приведена карта оценки культуры НЕр-2-КД, отправленной в монослое в герметично закрытых флаконах из СНИИВИ в Калининградскую облСЭС.

22693 . 4

Длительность транспортировки

7 дн, температура внешней среды в момент отправления клеток в г. Свердловске - 7 С, при получении в

r. Калининграде 1 С, после транспортировки в. биологически активном состоянии на стекле сохранилось

43,7Х клеток. При посеве в первом пассаже 2 млн. клеток в 50 мп среды монослой бып сформирован на 6-. й

f0 день, на третьем пассаже клетки бомому штамму вируса оказалась перевиваемая культура НЕр-2-КД, титр вируса на которой достигает 6 ед.

Tgg >4 с образованием характерных симпластов.

55 лее активно делились и монослой сфор— мировался на третьи сутки.

После третьего пассажа клетки были использованы в плановой работе, на них были вццелены вирусы полио

1, 2, 3, Коксаки ВЗ, В5, ECHO 4, 6, 9.

При длительности транспортировки до 5 сут нри температуре воздуха не ниже -10 С на стекле сохраняето ся до 80-90Х клеток и они используются в работе- с 2-3 пассажа.

На клетках НЕр-2-КД была выявле25 на более широкая выделяемость энтеровирусов в сравнении с первичной тканью фибробластов эмбрионов человека.

В табл. 2 представлены сравнитель ные данные по выделяемости энтерови— русов на двух клеточных культурах.

Пример 4. Использование клоновой линии перевиваемых клеток

НЕр-2-КД для приготовления эритроцитарного диагностикума PC-вируса.

Для культивирования PC-вирусов ненеобходимо использовать такую клеточную культуру, которая была бы чувствительной, обеспечивала накопление вируса в инфекционном титре

Щ не ниже 4-6 Т8 rmSO и отличалась стабильностью своих культуральных и морфологическнх свойств. В опытах были использованы перевиваемые кле45 точные культуры НЕр-2 HeLa Д-6

Э Э и первично-трипсинизированные ФЭЧ и ПЭЧ человеческого происхождения, а также перевиваемые клетки животного происхождения ПИС, СПЭВ и ПЭБ.

Вирус адаптировали к каждому клеточному штамму в ряду последовательных пассажей и определяли его инфекционную активность.

Наиболее чувствительной к иэучае. S f122693

В табл.З.дана чувствительность кле- Использование культуры НЕр-2-КД точных культкр к РС-вирусу (итамм ф. позволяет отработать условия полуСпецифические .изменения на пере- чения стабильных серий эритроцитарвиваеиых клетках обычно. появляются ного диагностикума респираторнона один-два дня раныпе по сравнению S синтициального вируса. в условиях с первичными культурами.: ..производства.

Таблица f

Ноказатели активиос ги

Серотипы вирусов Коксакн В Г»

Â1 82 ВЗ В4 ÂS В6

Инфекционная активность у

Tq" уо . ц

8,! 6,0 8,1 S 5 7,0 8,0 Сенеибилизируафая активность, ед титра сыворотки в РНГА

8 5 - 9.,7 11 1 10,1 11 0 7,5

Таблица 2 удельный вес выделенных итаммов, X

Вирусы

НЕр-2-КД

ФЭЧ Полиовирусы

8,0

3,0

Коксаки

53 0

8,0

34 О

ECHO f .à б л и ц а 3

Наличие цитопатического эффекта

Сроки появления цито- Накопление патнческого эффекта, вируса, ед дн ТПД и„

Клеточные культуры

4-6

HeLa

3-4

ПМС

СПЭВ

1-1,5 -2

КВ

ПЭБ

ПЭЧ

О

О

3-4

П р и м е ч а н и е: + - наличие цитопатического эффекта, 0 - отсутствие цитопатического эффекта.

IHIONR Зава 8100/23 Тараи 521 Подписное

ONaa4a ИНП Ч3атейт", г.Уагород, ул.Проектная, 4