Способ получения плазмидной днк

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ш1АЗМВДНОЙ ДНК из микробной биомассы, включающий лизис клеток, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкрсти спиртом, очистку от примесей РНК с помощью РНКазы, о тличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта , лизис клеток проводят щелочным раствором додецилсульфата натрия при соотношении биомасса : буферный раствор : щелочной; раствор додецилсульфата натрия 1 : 19 :

СООЗ GOBETCHHX ввюв .РЕСПУБЛИК

„SU.„1124933 А у@ С 12 и 15/00; С 07 Н 21/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;: (1 в в втовсвов в овиовтвъотвв

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТКОЙ.(21) 3555304/28-13 (22) 16.02.83 (46). 15.11.84, Бюл. У 42 (72) А.М.Зилбере, А.Б.Шафранский, Я.ЯвХартмане, С.Э.Ансберга, И.О.Муйжниекс и А.А.Камрадзе (53) 575.113(088.8) (56) 1 ° Clevell D.Â. and. Helinski D.R.

"Proc. Nath. Acad. Sci. USA", 1969, 62, 1159-1166.

2. ВiгпЬоип Н.С. and Doly J. "Nuc-

leic Acids Res 1979, 7, В 6, р. 1513-1523. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИДНОЙ

ДНК из микробной биомассы, включающий лизис клеток, центрифугирование, осаждение целевого продукта из надосадочной жидкости .спиртом, очистку от примесей PHK с помощью РНКазы, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, лизис клеток проводят щелочным раствором додецилсульфата натрия при соотношении биомасса : буферный раствор : щелочной: раствор додецилсульфата натрия 1 : 19 : (37-45). а очистку от PHK осуществляют РНКазой в присутствии 1,0-3,0 мМ ЭДТА.

33 2

1 11240

Изобретение относится..к биохимии и может быть использовано для решения научно-исследовательских и прикладных задач при выделении и очистке плаэмидной ДНК в упомянутой области, а также в микробиологии, медицине, генной

5 инженерии.

Плаэмидная ДНК является объектом,, используемым в генной инженерии в качестве векторных молекул, а также как субстрат для многих ферментов, в том числе эндонуклеаз рестрикции, как тест-ДНК.

Известен способ получения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Клет15 ки суспендировали в буфере, разрушали лизоцимом, балластные белки отделяли с помощью додецилсульфата натрия. Для очистки препарата испольэовали хлороформ иэоамиловый спирт и фенол. По1

20 получаемый препарат ДНК содержит много примесей хромосомальной ДНК и РНК (1»

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ковалентно-замкнутой кольцевой плаэмидной ДНК, включающий следущие стадии: суспендирование бактериальных клеток в трис-буфере содержащем глюкозу,лизоцим, инкубирование при 0, лизис щелочным раствором

30 додецилсульфата натрия, нейтрализац.ао (смеси ацетатом натрия и центрифугирование. Плаэмидную ДНК дважды переосаждают спиртом и ннкубируют с ,РНКазой 52). 35

Однако для известного способа характерен недостаточно высокий выход целевого продукта.

Целью изобретения является увеличение выхода плазмидной ДНК.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения плазмидной ДНК из микробной биомассы, включающему лиэис клеток, центрифугирование, осаждение целевого про45

;дукта из надосадочной жидкости спиртом, очистку от примесей РНК с помощью

РНКазы, лизис клеток проводят щелочным раствором додецилсульфата натрия при соотношении биомасса : буферный 50 раствор : щелочной раствор,додецилсульфата натрия 1:19(37-45), а очистку от РНК осуществляют РНКазой в присутствии 1,0-2,0 мМ ЭДТА.

Способ осуществляот следующим 55 образом.

Повышение выхода обеспечивается

sa счет сохранения суперспиральной структуры ДНК в процессе лиэиса

Понижение количества додецилсульфата натрия и натра едкого, которые в среду вводятся в определенных соотношениях, т.е. в количествах, определяющих возможность регулирования лизиса с-целью сохранения ковалентно связанной кольцевой плазмидной дНК, а условия инкубации обеспечивают разделение ковалентно-замкнутой кольцевой . плаэмидной ДНК от балластных веществ.

Условия лизиса и инкубации предотвращают релаксацию ковалентно-замкнутой кольцевой плазмидной ДНК в линейную и открытую кольцевую ДНК.

Предлагаемый способ обеспечивает накопление ковалентно-замкнутой кольцевой плаэмидной ДНК 95-96 . Процесс очистки от PHK проводят ферментом

РНКаэой {0,8-0,81 мкг на 1 мг суммаррых рибонуклеиновых кислот) в присутствии 1,0-3,0 мМ ЭДТА (динатриевая соль этилендиамин N — М вЂ” г(— и (I

-тетрауксусной кислоты) .

Введение ЭДТА подавляет активность нуклеаэ, так как нуклеаэы являются металлозависимыми ферментами, Э((ТА связывает ионы металла и ферментный центр инактивируется.

В предлагаемых условиях присутствие ЭДТА активирует каталитическую способность РНКазы, так как РНКаэа не является металлозависимым ферментом. Присутствие ЭДТА напротив повышает ее активность.

Предлагаемый способ направлен на сохранение структуры плаэмидной ДНК, конфигурации ее цепи, на предотвращение раскручивания цепи.

Цепи удерживаются вместе благодаря образованию трех водородных связей,между гуанином (6) и цитоэином (Ц) и двух водородных связей между аденином. (А) и тимином (Т). Однако стабильность двойной спирали в основном определяется взаимодействием параллельно-)(-электронных систем оснований.

Пример 1, 40 r биомассы

Eicherichia coli HB 101 ресуспендируют в 750 r буфера, состоящего из мМ: ЗДТА 10, глюкоза 50, трис-НС

25, рН 8,0.

Добавляют 1,5 KF 0,8 -ного додецилсульфата натрия в О, 1 н. NaOH и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,075 кг 3М ацетата натрия, рН 4,8. Оставляют при 0 — +4оС в течение 1 ч. Осадок отделяют центрифугиСоставитель В. Кузьмичев

Редактор М. Дылын Техред С.Мигунова Корректор А Зимокосов

Заказ 8208/24

Тираж 521

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент". r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 11240 рованием. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, дважды переосаждают охлажденньп этанолом (6,65 кг) . Полученный осадок после центрифугирования ресуспендируют в 50 мл буфера, состо- ящего из мМ: трис-НС1 10, рН 7,6, МаС 10, ЭДТА 10, добавляют активированную РНКазу из расчета 50 мкг на 700 мл сумма.:.ных рибонуклеиновых кислот и инкубируют 30 мин при 37 С. 10

Инкубат дважды переосаждают охлажденным эталоном. Осадок ресуспендируют, в 20 мл буфера, состоящего из, мМ: трис -НСВ 10, рН 7,6, NaC6 10, ЭДТА 10. 15

Концентрацию ДНК плазмиды определяют по формуле

С = А 26о а 50, где С вЂ” концентрация плазмидной

ДНК, мкг/мл; 20

А — оптическая плотность при длине волны 260 нм; а — кратность разбавления;

50 — коэффициент, соответствующий

1 оптической единице 1ри цлине 25 волны 260 нм, мкг/мл;

С = 0,76 40 50 = 1520 мкг/мл = — 1,52 мг/мл.

Общий выход ДНК плазмиды 30,4 мг при объеме 20 мл 0,076 .. Содержание ковалентно-замкнутой кольцевой

ДНК 95, Пример 2. 40 г биомассы

Eicherichia coli НВ 101 ресуспендируют в 750 r буфера, состоящего из, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 50,трис-НС9 25, рН 8,0. Добавляют 1,7 кг 0,8 -ного

33 4 додецилсульфата натрия в 0,1 í. НаОН и перемешивают. в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,2 кг ЗМ ацетата, натрия, рН 4,8.

Далее процесс проводят по примеру 1, но в буфере для инкубации с РНКазой концентрацию ЭДТА доводят до 2,0 мМ.

Концентрацию ДНК определяют по формуле

С = A26o а .50 = 0,68"40 50 =

1360 мкг/мл = 1,36 мг/мл.

Общий выход ДНК плазмиды 28 мг при объеме 20,6 мл 0,07 X. Содержание ковалентно-замкнутой кольцевой

ДНК 95,5 .

Пример 3. 40 r биомассы

Eicherichia со1i ЧВ 101 ресуспендируют в 750 г буфера, состоящего из, мМ: ЭДТА 10, глюкоза 50, трис -НС1 25, рН 8,0. Добавляют

1,82 кг 0,8 .-ного додецилсульфата натрия в 0,1 н. ИаОН и перемешивают в течение 5 мин при комнатной температуре. Смесь нейтрализуют добавлением 1,3 кг ЗМ ацетата натрия, рН 4,8.

Далее процесс проводят по примеру 1, но в буфере для инкубации с РНКазой концентрацию ЭДТА доводят до 3,0 мМ.

Концентрацию ДНК плазмиды в мкг/мл определяют по формуле

C = Адьо а 50 = 0,65 40*50 = — 1300 мкг/мл = 1,3 мг/мл.

Общий выход ДНК плазмиды 27,3 мг при объеме 21,0 мл 0,068 .. Содержажие ковалентно-замкнутой кольцевой

ДНК 96,