Штамм @ @ @ @ @ -1215-продуцент гидрогеназы

 

. ШТАММ CALDEROBACTERIUM HYDROGENOPHILUM NOV.GEN.NOV.SPI ИНМЙ-Z - 215 (коллекция Центрального музея промьшшенньп микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2695) -ПРОДУБИТ ГИДРОГЕНАЗЫ. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИ ..1

691 ml

А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3623081/28-)3 (22) 13.07.83

{46) 23.1).84. Вюл. N 43 (72) Н.Д.Савельева, M.À.Пушева, В.P.Êðþêîâ и Г.А.Заварзин (71) Институт микробиологии АН СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Емнова Е.Е., Романова А.К.

Характеристика термофильной водородной бактерии Hydrogenomonas thermophi2us. "Микробиология", 1977, У 46, вып.3. с.405-407.

2. Pinkward.М., Schneider k.a.

Sch2ege2 nJ,FEMS Microbio2. Let.1983, 17,137-14.1.

3. Авторское свидетельство СССР

У 566879„ N 9/02, 1976.

3(Я) С 12 И 9/02; C )2 N 15/00;

С )г К 1/01 (54) (57) ШТАММ СЖЭЕКОВАСТЕКП)М

HYDROGENOPBILUN NOV.GEN.N0V.ЯР3

ИНМИ-, -)215 (коллекция Центрального музея промъппленных,микроорганизмов института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦМПМ В-2695) -ПРОДУЦЕНТ

ГИДРОГЕНАЗЫ.

5 1 аэробио окисляющая водород. Растет в жидкой минеральной среде в атмосфере газовой смеси, состоящей из

75Х водорода, 15Х кислорода и 10 углекислого газа.

Культурально-морфологические. признаки: клетки штамма 3 -1215 представляют собой грамотрицательные неподвижные палочки размером 0,350,5х2,0-3,0 мкм. Деление клеток происходит септированием, организм спор не образует. На агаризованной минеральной среде дает мелкие округлые блестящие серовато-белые колонии.

Лучше растет в жидкой культуре.

Суспензия клеток серо-белая, опалесцирующая, н старых культурах светлокоричневая. Организм лучше растет при перемешивании жидкой среды, чем в стационарных условиях. Опя 4мальная температура роста 75-78 С.

Нижний предел развития клеток opvaниэма отмечен при 50 С, верхний прео дел при 82 С. Сохраняет жизнеспособо ность при 90 С в течение часа. Про- . о о должительную инкубацию при 90 С и более высокой температуре не выдерживает.

Для выращивания С.ЬуйгорепорЬх1иш

Е-1215 используют минеральную среду

Шлегеля с вдвое уменьшенным содержа- нием фосфатов. Состав среды (конечные концентрации) г/л;., NH

КН Р0 0,75; На НРО КН О 4,5;

NgS0g 0,2; СаС12 0,02; Fe(NH4)C< Н50

0,012.

В среду добавляют микроэлементы

2 мл/л. Смесь микроэлементов Хоаглан да на 200 мл Н О, мг: Н ВО 22,8;

СаС12 ° 6Н О 8,0; CuS04 ° 5Н О 0,8;

MnC1> ° 7Н О 0,8; ZnSO ° 7HZ0 1,76: .Ма МоО 2Н О 5: NiCI 0,8.

Физиолого-биохимические признаки.

Облигатный автотроф, т.е. растет исключительно sa счет аэробного

) окисления водорода. Органические ве вещества культурой не используются, в факторах роста не нуждается. В качестве единственного источника азота штамм Я-1215 использует соли аммония, нитраты, хуже мочевину, Нитрит не использует, способность к фиксации молекулярного азота не обнаружена. Отмечается чувствительность к антибиотикам — пенициллину и рифампицину. Пенициллин в концентрации 100 мкг/мл и рифампицин

10 мкг/мл полностью ингибируют развитие организма.

1 112524

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частнос ти к получению ферментов микробного происхождения.

Известны термофильные продуценты гидрогеназ-Pseudomonas thermophila (13, Ьасй 1из Sehegelii (2) . Для P.thermbphila оптимум температуры для гидрогенаэы приходится на 50ОС (активность фермента здесь достигает 0,22 Е}, а 1О при кратковременном нагревании до

80 С активность теряется полностью.

Мембраносвязанная гидрогеназа В. schle.

8е1Ы имеет оптимум температуры между

70 и 75ОС и активность 26,1Е. Е— удельная активность, означающая превращение 1р М субстрата за 1 мин/1 мг белка.

Наиболее близким к изобретению по активности и стабильности фермента является штамм мезофильной бактерии

Thiocapsa roseopersicina, гидрогеназа которого имеет оптимум активности при 75 С и достигает 80 Е, причем активность фермента сохраняется через 5 о

10 мин после нагревания при 70 С.

Период палуинактивации в аэробных условиях при 37 С 80 ч (3).

Недостатками известных штаммов являются йевысокая активность гидрогеназы, ее способность окислиться кислородом .воздуха и ее недостаточно высокая термостабильность.

Целью изобретения является штамм новой экстремально-термофильной облигатно автотрофной водородной бактерии Caldегоbacteriun hydrogenophi1um nov. gen. nov. sp. ИНМИ-g-1 215продуцента гидрогеназы, обладающей высокой активностью(200 Е)(коллекция

Центрального музея промьппленных микро40 организмов института"ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦМПМ В-2695), . отличающийся большой термостабильностью(температурный оптимум действия

85 С)и с. абильностью к кислороду 45 при выделении и хранении(период полуинактивации при хранении 8 дн).

Препараты стабильной гидрогеназы

С. Pydrogenophilum могут быть исполь зованы в качестве катализатора в 5п системах биоконверсии энергии для получения топливных электродов., Штамм Caldегоbacterium hydrogenophilum Z-1215 выделен из альгобактериальных матов газогидротермаль-55 ных источников Камчатки. Это экстремально-термофильная облигатно хемоавтотрофная водородная бактерия, Э 1125

При выращивании в жидкой минераль .ной среде в атмосфере смеси водорода, кислорода и углекислого газа максимальная .удельная скорость роста

-1 клеток достигает 0,4 ч, время

5 генерации 2 ч.

Штамм С.hydrogenophilum Z-1215 для получения из него термостабильной и оксистабильной гидрогеназы выращивают на жидкой среде Шлегеля в атмосфере газовой смеси из водорода, кислорода и углекислоты (75:15:10) при оптимальной температуре роста

76 С в ферментере АК-3-1 (скорость вращения 750 об/мин). Культура

t$ является продуцентом высокоактивной и термостабильной гидрогеназы.

Удельная активность гидрогеназы штамма Z -1215 составляет 200 шМ мин мг . Максимальная активность гидрогеназы наблюдается в конце фазы линейного роста культуры(через,20 ч с начала культивирования). Температурный оптимум активности гидрогеназы лежит в пределах 76-90 С. При О о температуре ниже 50 С гидрогеназная активность не обнаружена. Прогревание препарата фермента в течение

1 ч при 60-90 не снижает активности о

-и не приводит к коагуляции белков.

Ценным свойством препаратов гидро30 генаэы, продуцируемой предлагаемым организмом, является ее устойчивость к кислороду при хранении. Сравнительное изучение изменений активности фермента при его хранении в атмосфе- 35 . ре водорода при 40 С и на воздухе о в замороженном состоянии показало, что период полуинактивации в обоих случаях составляет 8 дн, т.е. данный фермент оксистабилен.

Пределы рН для .гидрогеназы Ca l dегоbac ter ium hydrogenophi lum достаточно велики, она проявляет активность в пределах рН 5,5 — 13. Максимум активности при рН 7,0. Активность 45 гидрогеназы определяют в бесклеточных экстрактах. Для получения бесклеточного экстракта осадок клеток суспеидируют в 0,05 М фосфатном буфере рН 7 и разрушают 5 мин при 50

0 С в дезинтеграторе при частоте

22 кГц. Неразрушенные клетки и оеколки.клеток отделяют центрифугироваа Г"; д нием(20 10>, 30 мин, О С) . Полученную надосадочную жидкость используют 55 для определения активности гидрогена. зы. Гидрогеназную активность определяют спектрофотометрически с метиле245 новым синим-и бензилвиологеном в качестве акцепторов электронов.

Реакцию ведут в трубках Тунберга в атмосфере водорода при 76 С.

О

Атмосферу водорода создают многократным откачиванием под вакуумом и заполнением трубки газом. Реакционную смесь, содержащую 60 мИ трисHCl 7,4, 50 мИ метиленового синего или 20 мМ бензилвиалогена в основном пространстве трубки и фермент (1 мг белка}в боковом отростке, термостатируют, в течение 10 мин при температуре ат 50 да 95 С. Реакцию начинают приливанием фермента иэ отростка и энергичным встряхиванием. Контрольный вариант не содержит переносчика электронов и заполняется аргоном. Общий объем реакционной среды 1,6 мл. Кинематические кривые поглощения Н снимают в спектрофато" метре "Specord" c термостатирующим устройством. Восстановление метилено. ваго синего и бензилвиологена, ката лизируемое гидрогеназой, регистрируют при 600 нм. Содержание белка определяют по Лаури. Ферментный препарат хранят под водородам при 4 С на воздухе при -5 С..Скорость реак-о ции и активность гидрогеназы определяют:. по линейному участку кинетической кривой с использованием малярных коэффициентов экстинкпии ! для метиленовога синего 26;4 10 моль/сй и для бензилвиалогена 7,55 10 моль/см, Гидрогеназа(Е С 1.12.) -флавопроте" иновый фермент, обладающий низким окислительно-восстановительным потенциалом(Е0,42 В}, катализирующий обратимую активацию молекулярного водорода Н =2К +2е и способный

2 использовать акцепторы электоронов с широким диапазоном акислительнавосстановительных потенциалов: метиЛвиологен, бензилвиологен, НАД, ФИН, ФАД,метиленовую синь, цитохром С, феррицианид и нитрат.

Удельная активность гидрогеназы выделяемой из Са1йегоЬас егжш hydroдепорМ1щпштаммЕ-1215,возрастает по.мере роста культуры. Максимальная удельная активность фермента отмечается в конце линейной фазы роста. При переходе культуры на стационарную фазу удельная активность фермента снижается на 25Х от максимальной.

Пример 1. Культуру выращивают автотрофно в ферментере на 3 л

20

Составитель И.Привалова

Редактор Н.Джуган Техред С.Легеза Корректор А.Обручар

Заказ 8435!18 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР пр делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

11252 загрузка 100 — жидкая среда 66, азовое питание - 34X). Используют минеральную среду Шпегеля. Посевной материал — 200 мл суспензии клеток, выращенных автоурофно в колбах при 5

75-. asoaoe питание для культуры подается из баллонов через систему редукторов. Скорость продувки газовой смесью, состоящей из 75% Н2, 15 X Og H 1о % со,, 500 мл/MHH 10

Ферментация идет при 76 С. Автотрофо ный рост штамма 2 -1215 в этих условиях характеризуется 12-ти часовой фазой задержки роста и последующим быстрым развитием, которое заканчива 15 ется за 10 ч т.е. за это время культура выходит на фазу стационар ного. роста. Время выращивания в данном случае 10 ч. Удельная активность ферментного препарата гидрогеназы из клеток штамма Х -1215 к этому моменту (культура на стадии д стационарного роста) 150 шМ мин мг, Активность гидрогеназы определяют спектрофотометрическим методом по 25 скорости восстановления бензилвиолоо гена в атмосфере водорода при 70 С в анаэробных термостатируемых кюветах.

Пример 2. Культуру выращивают по примеру 1. В конце фазы линейного роста(через 8 ч с начала роста и

20 ч с начала культивирования)определяют активность фермента гидрогеназы по примеру 1. Удельйая активность

5 гидрогеназы из клеток Caldегоbacterium hpdrogenophilum 2-1215,200 рМ мин мг .

Препараты стабильной гидрогеназы

С.hydrogenophilum могут быть использованы в качестве катализатора в системах биоконверсии энергии для получения топливных электродов в электрохимнческих преобразователях.

В лабораторных условиях исследована возможность создания водородного электрода биохимического топливного элемента с участием гидрогеназы из Thiocapsa rosepersicina. Малая эффективность системы связана с низкой активностью фермента (40 Е), иммобилизованного в полупроводниковых материалах, Новая экстремально-термофильная водородная бактерия Caldегоbacterium

hydrogenophilum по гидрогеназной активности значительно превосходит все известные штаммы бактерий, способных продуцировать этот фермент.

Поэтому штамм Е -12)5 этой водородной бактерии можно. рассматривать как ценный и перспективный продуцент высокостабильной гидрогеназы для использования ее в качестве электрокатализатора в системах биоконверсии энергии.

Кроме использования в качестве продуцента гидрогеназы, штамм

С.hydrogenophifum Z-1215 можно рассматривать как источник пищевого и кормового белка (60% от сухого веса клеток) с высоким содержанием аминокислот (36X).

Способность предлагаемого штамма расти при высокой температуре о (70-75 С) почти полностью исключает возможность. заражения среды посто .. ранней микрофлорой.