Способ получения спин-меченых эфиров холестерина или спин- меченого лецитина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПИН-МЕЧЕНЫХ Э«ШРОВ ХОЛЕСТЕРИНА ИЛИ СПИН-МЕЧЕНОГО ЛЕ1ЩТИНА путем ацилирования холестерина или лизолецитина спинмеченой карбоновой кислотой в присутствии конденсирующего реагента в среде органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью повьшения выхода целевьЬс продуктов и сокращения продолжительности процесса, в качестве конденсирующего реагента используют арилсульфотетразолид и процесс проводят в при-сутствии нуклеофнльного катализатора при комнатной температуре. г 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ .и и с я тем., что холестерин или &) лизолецитин, спии-меченую карбоновую кислоту, арилсульфотетразолид и нус клеофильный катализатор используют в молярных соотношениях 1:1:1:2,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК,SU„„1126574

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГГИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. г

:м, (21) 3635О69/23-,,04 (22) 22.08.83 (46) 30. 11. 84. Бюл.N 44 (72) А.10.Мишарин, Н.Г.Бушмакина и Б..К.Чернов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр (53) 547 ° 26 .118 ° 07(088 ° 8) (56) 1. Hubbell W.L., Мс. Connell Н.М.

Molecular Mobion in Spin-Labeled

Phospholipids and Membranes. "J,Am, Chem.Soc"., 1971, 93, 314-326.

2. Суханов В.А., Жданов P.È., Швец В.Н.,Евстигнеева P.П. Биологически-активные стабильные радикалы

IX. Синтез фосфатидилхслина, содер.жащего спин-меченый ацильный остаток. в положении l .(3 1.-"Биоорганическая химия", 1978, 4, с.785-790 (прототип).

Вар С 07 J 9/00- С 07 F 9/10 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПИН-МЕЧЕНЫХ ЭФИРОВ ХОЛЕСТЕРИНА ИЛИ СПИН-МЕЧЕ.НОГО ЛЕЦИТИНА путем ацилирования холестерина или лизолецитина спинмеченой карбоновой кислотой в присутствии конденсирующего реагента в среде органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью повьнйения выхода целевых про" дуктов и сокращения продолжительности процесса, в качестве конденсирующего реагента используют арилсульфотетразолид и процесс проводят в при-сутствии нуклеофильного катализатора при комнатной. температуре.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - g шийся тем, что холестерин или лизолецитин, спин-меченую карбоновую кислоту,. арилсульфотетразолид и иуклеофильный катализатор используют в молярных соотношениях 1:1:1:2. O

1126574

30 — у»

СН ОСОИ

40

50

О

II

С55

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к усовершенствованному способу получения спин-меченых эфиров холестерина и спин-меченого лецитина, которые широко используются в различных биохимических, биофизнческих и медикобиологических исследованиях для изучения топографии и функционирования биологических мембран, липидно-белковых.комплексов, липидных дисперсий и пленок, липосом и липопротеинов плазмы.

Известен способ получения спинмеченых эфиров холестерина и спинмеченого лецитина ацилированием холестерина и лиэолецитина ангидридами спин-меченой карбоновой кислоты 1 (.

Недостатками этого способа являются низкий выход (507)целевых продуктов и большая длительность процесса (8-!2 ч).

Наиболее близким к изобретению . по технический сущности и достигаемому результату является способ получения спин-меченых эфиров холестерина или спин-меченого лецитина ацилированнем холестерина или лизолецитина избытком спин-меченой карбоновой кислоты s присутствии конденсирующего реагента — карбонилдиимидазола при нагревании до 50оС (2), К недостаткам этого способа отно"сятся: невысокий выход целевого продукта, не превьппающий 40-50% ; требование избытка спин-меченой кислоты, необходимость проведения реакции в атмосфере инертного газа, длительное время проведения процесса (6-8 ч ), жесткие условия (продолжительное нагревание до 5" С ), приводящие к заметной деградации исходных продуктов.

Цель изобретения — повьппение выхода целевых продуктов и сокращение продолжительности процесса.

Поставленная цель достигается согласно способу получения спин-меченых эфиров холестерина или спинмеченого лецитина ацилированием холестерина или лиэолецитина спин-меченой карбоновой кислотой в присутствии конденсирующего реагента— арилсульфотетразолида и нуклеофильного катализатора в среде органического растворителя прн комнатной температуре.

При этом холестерин или лизолецитин, спин-меченую карбоновую кислоту, арилсульфотетраэолид или нуклеофильный катализатор используют в молярных соотношениях 1:1,1, 2.

Процесс проводят следующим обра5 эом, Эквимольные количества холестерина или лизолецитина, спин-меченой карбоновой кислоты и арилсульфотетраэолида высушивают упариванием с

l0 толуолом, добавляют инертный растворитель и 2-кратный молярный избыток нуклеофильного катализатора.

Через 30-60 мин наблюдается полное превращение исходных компонентов в

15 целевой продукт.

Предлагаемый способ осуществляется по схеме:

Н

О

11 + сн, Оюа(с,)рт(сн,), О сн осоа 0 H

О

СН|ОРО(СНр ) ух(СЯ ) 3

1126574

4 рнвают с абс.этанолом, кристаллизуют из этанола, маточник концентрируют, отделяют выпавшие кристаллы, объединенный продукт кристаллиэуют из 96Х-ного этанола, сушат в вакууме. Т.пл.158 С. Выход 136 мг (0,25 ммоль ), 85%, Rf (бенэол;этилацетат 9 1) — 0.,53.

Rf (толуол:эфир 9;! ) †. 0,50.

0 Спектр ЭПР (бенэол): острый триплет, d<15,4 гс, концентрация радикала 5,7 (+0,5) 10 спин/моль.

R — - остаток жирной кислоты.

В предлагаемом способе используют арилсульфотетразолиды: мезитиленсульфотетразолид или 2, 4, 6-триизопропилбензолсульфотетраэолид.

В качестве спин-меченых карбоновых кислот применяют 2, 2, 5, 5-тетраметилпирролидин-l-оксил-.3-карбоновую 15 или 9(2 -спиро-4, 4 -диметилоксазоI t f лидин-3 -оксил)-тридекановую кислоI ты. Нуклеофильным катализатором служит 4- диметиламино )-.пиридин в инертном растворителе (абс.бензоле, абс. 20 ацетонитриле, абс.хлороформе или их смесях), .Иные. чем эквимолярные соотношения холестерина или лизолецитина, спин-меченой карбоновой кислоты и .25 арилсульфотетразолида приводят к ненужной затрате реактивов и последующим затруднениям в очистке целевого продукта от непрореагировавших исходных компонентов. 30 .Более чем 2-кратный молярный избытой нуклеофильного катализатора затрудняет выделение и очистку целевого продукта. Использование меньших количеств катализатоРа приводит 35 к уменьшению выхода и снижению скорости процесса.

В предлагаемом способе впервые для ацилирования холестерина и лиэо-" лецитина спин-мечеными карбоновыми 40 кислотами в качестве конденсирующего реагента использованы арилсульфотетразолиды (меэитиленсульфотетразо-. лид или 2, 4, б-,триизопропилбензолсульфотетразолид).

Пример 1 . Смесь 116 мг (0,3 ммоль )холестерина, 56 мг(0,3

1 ммоль ) 2,2,5,5-тетраметилпирроли-. . дин-1-оксил-3-карбоновой кислоты сушат упариванием с толуолом, раство- 50 ряют в 1 мл абс.бензола и 1 мп абс. ацетонитрила, добавляют 83 r (0,39 ммоль ) мезитиленсульфотетразолида, 80 мг (О,бб.ммоль ) 4-(.диметиламино)циридина и перемешивают 30 мин . 55

К смеси добавляют 5 мп бенэола, промывают 3 2 мл насыщенным раство-. ром NaHCO>, 3 2 мл воды, сушат, упа-,.

При щелочном гидролизе (1 н. КОН в смеси метанол:вода 4:1, 4 ч кипячения) продукт дает исходную спинмеченую кислоту (К -соль) и холестерин.

Пример 2. Смесь 20 мг (63 мкмоль ) 9 — (2 —.спиро-4,4 -диметил! 1

I оксаэолидин-3 -оксил)-тридекановой кислоты, 25 мг (65 мкмоль ) холестерина высушивают упариванием с толуолом, растворяют в 1 мп абс. бенэола, добавляют 23 мг (68 мкмоль) 2,4,6-триизопропилбензолсульфотетразолида, 18 мг (140 мкмоль ) 4-(диметиламино)пиридина, перемешивают 1 ч добавляют

3 мл толуола, промывают 3 2 мл насыщенного раствора NaHCO>, 3 2 мл воды, сущат, упаривают, растворяют в 0,5 мл толуола и наносят на колонну 1,2 «10 см SiO>, уравновешенную толуолом, промывают 12 мл толуола.

Желтую фракцию элюируют смесью толуол:эфир 9, 1 упаривают, кристаллиэуют из абсолютного метанола, сушат в вакууме. Выход 41 мг (58 мкмоль). Т.пл. 48 С (927.).

Rf (бензол;этилацетат 9,1 ) — 0,63.

Rf (толуол:эфир 9: 1 ) — 0,67.

Спектр ЭПР (бензол острый триплет, а> )5,4 гс, концентрация радикала 5,9(+0,51 1О -"спин/моль.

Пример 3. Смесь 20 мг (63 мкмоль .) 9-(2 -спиро-4, 4 -ди( метилоксазолидин-3 -оксил )-тридекановой кислоты, 40 мг (около 70 мкмоль) лиэолецитина высушивают упариванием с толуолом, добавляют 1 мл абс.ацетонитрила> 20 мг (80 мкмоль ) мезитиленсульфотетраэолида, 24 мг (200 мкмоль) 4-(диметиламино)-пиридина и перемешивают в эвакуированной колбе

30 мин, затем добавляют 2 мл хлороформа, перемешивают 30 мин, затем

2 мл метанола, 3 мл хлороформа", раствор промывают 3 2 мл насыщенным раствором NaHCOg водный слой эксI )1265

Составитель М. Красновская

Редактор Т.Колб, Техред Ж.Кастелевич . Корректор Н.Король

Заказ 8634/18 Тираж 380 Подписное

ВНИИПИ Государственного коиитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Яосква, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная 4

S трагируют 3 .3 мл смеси хлороформа и метанола (2 .1}. Обьединенный органический слой промывают Зи2 мл насыщенного раствора Na 80+, сушат

Na S0+, упаривают со 150 мг SiO, смесь наносят на колонку 1,2 10 см

Sip, уравновешенную смесью хлороформ;метанол 4 1, промывают 30 мл смеси хлороформ:метанол 4 ll,,элюируют желтую зону смесью, хлороформ:, 10 метанол.аммиак (конц.) 12,8 .l. Продукт — гомогенное по ТСХ желтое масло..

Rf (хлороформ:метанол1аммиак конц. 65 35 .1 ) — 0,62, .15

Rf (хлороформ:метанол;вода 65l25) .8 ) — 0,40.

Спектр ЭПР (метанол): острый триплет, а 15,2 гс, концентрация радикала 5,8 (i0,5 ).10 спин/моль З1 фосфата.

Продукт полностью гидролиэуется фосфолипазой А яда кобры (Naja

naja ), давая исходную спин-меченую кислоту и лиэолецитин (контроль - 25

ТСХ ), полностью омыляется н. раствором КОН (метанол:вода 4:1 ).

Выход 60 мг (58 мкмоль фосфата ), 89%.

Таким образом, предлагаемый спо- Эр соб позволяет повысить выход спинмеченых эфиров холестерина и спинмеченого лецитина с 40-50 до 85-92%, сократить продолжительность процесса от 6-8 до 0,5-1 ч.

Кроме того, способ характеризуется сравнительно мягкими условиями реакции получения целевых продуктов, он прост в исполнении и не требует нагревания, работы в атмосфере инертного газа, проведения реакции в гетерогенных смесях, что характерно для известного способа (.21.

Для получения целевых .продуктов, не требуется также избытка спин-ме- . ченой карбоновой кислоты, что позволяет избежать непроизводительность расходов этого дорогостоящего и труднодоступного реагента.

Спин-меченые эфиры холестери. а и спин-меченый лецитин используются для изучения структуры и функции биологических мембран,липопротеинов плазмы крови, для исследования белково-липидных взаимодействий в основных компонентах плазмы крови и их моделях. Простота получения спинмеченых лнпидных зондов с помощью предлагаемого способа позволит шире использовать их в различных исследованиях, в частности для изучения молекулярных основ таких заболеваний, как атеросклероз и дислипопротеидеЪ мии.