Урокиназа,иммобилизированная на фибриногене

 

Урокиназа, иммобилизированная на фибриногене, общей формулы P-C-NH-(CH2)n-NH-C-E J f, О где Р - фибриноген, Е - урокиназа, п - О, 4, 7, 10, 12, обладающая пролонгированной тромболитической активностью и сродством к материалу тромба, характеризующаяся мол.мае. соответственно 36000, 385000 400000, 420000, 440000, содержанием белка соответственно 30, 15, 14, 12, (Л 10 мае.%,

СОЮЗ GOBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1128601 5 > С 12 N 9/72, 11/00 // А 61 К 37/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

®K6%3RAg

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ," ., .::":;;,,," -.,,:„., К ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

«»««» 4 (54) УРОКИНАЗА, ИИИОБИЛИЗОВАННАЯ НА

ФИБРИНОГЕНЕ. (57) Урокиназа, иммобилизированная на фибриногене, общей формулы

p — С вЂ” 1 Н-(СН ) д — ЮН вЂ” (. — Е

11 II

0 0 (2 ) 3590957/28-13 (22) 10.05.83, (46) 15.07.85. Бюл. Р 26 (72) А.B.Максименко, Е.Г.Тищенко, В.П;Торчилин, В.Н.Смирнов и Е.И.Чазов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР (53) 577.15(088.8) (56) 1. Т.Kitao, К.Hattori. Thrombos, Haemostas, 1980, 43, 70.

2. Патент США В 4106992, кл. 195-66 В, 1978.

3. Патент Японии Ф 113488, кл. ЗОА2, 1979.

4. V.P.Torchilin, А.V.Maksimenko, V.N.Smirnov, J.V.Berezin, К.Martinek, Biochim. Biophis Acta, 1979, 568, 1.

5. Авторское свидетельство СССР

М 824053, кл. С 01 N .33/86, 1979. где P — фибриноген, E — урокиназ а, n — - О, 4, 7, 10, 12, обладающая пролонгированной тромболитической активностью и сродством к материапу тромба, характеризующаяся мол.мас. соответственно 36000, 385000

400000, 420000, 440000, содержанием белка соответственно 30, 15, 14, 12, 10 мас.7, К,„(11, 0-18, О): 10 М

Кса, 21-33 рй-оптимум 7,4-7,8. б01.

) 1128

Изобретение относится к биоорганической химии, в частности к синтезу биологически активных соединений, обладающих сродством к материалу тромба и проявляющих тромболитическую 5 активность.

Предлагаемые соединения представляют собой продукт связывания урокиназы с фибриногеном. Фермент урокиназа широко используется в медицине для лечения тромооэмболий кровеносных сосудов. Фибриноген представляет собой белок крови и после превращения в фибрин под действием тромбина является строительным материалом тромбов. 1

Известны производные урокиназы, которые получают присоединением фермента к различным носителям. Так получают водонерастворимые производные урокиназы, например путем связы- 20 .вания ее с эритроцитарной массой $1).

Однако для терапевтических целей пригодными являются водорастворимые производные урокиназы, например электростатический комплекс фермента с гепарином (2) . К недостаткам подоб. ных производных относится их нестабильность.

Наиболее близким к известным производным является препарат, пред- 30 ставляющий собой урокиназу, ковалентно связанную с декстраном (3) .

Однако подобная модификация фермента не имеет сродства к материалу тромба и поэтому повышение общей фибринолитической активности крови при использовании таких производных не гарантирует эффективного осуществления процесса тромболизиса.

Цель изобретения — получение ново щ

ro препарата — иммобилизованной урокиназы, обладающей пролонгированной тромболитической активностью и сродством к материалу тромба.

Цель изобретения достигается 4$ свойствами иммобилиэованной урокиназы общей формулы г — e-x -(н, „— мн-с-E

11 )I

0 0 я где Р— фибриноген, F. — урокиназа, и — Ою 4в 7э 10, 12, характеризующейся мол.мас. соответственно 360000; 385000; 400000;

420000; 440000 и содержанием белка соответственно 30, 15, 14, 12, 10 мас.7, получаемой присоединением молекул фермента к фибриногену через алифатические днамины различной длины с предварительной активацией карбоксильных групп белков карбодиимидом.

Способ осуществляют в три стадии.

1. Активация карбоксильных групп фибриногена с помощью карбодиимида и присоединение к нему алифатического амина.

Этот процесс проводят по общепринятой методике (4) .

К раствору фибриногена в дистиллированной воде (рН 3,8) добавляют

100-кратный молярный избыток 1-этил-3(диметиламинопропил) карбомиида и инкубируют смесь 10 мин при комнатной температуре, после чего к ней о при рН 4, 5 и температуре 4 добавляют 100-кратный молярный избыток алифатического амина в фосфатном буфере рН 8,3 и инкубацию продолжают в течение 5 ч. Полученный продукт (1) диализуют против дистиллированной о воды при 4, а затем против фосфатного буфера рН 8,3, 2. Активация карбоксильных групп урокиназы с помощью карбодиимида.

К раствору урокиназы, предварительно отдиалиэованной против дистиг лированной воды и фосфатного буфера рН 8,3, добавляют 1-этил-3(диметиламинопропил)карбодиимид молярном

I л отношении 1: 100 и инкубируют при 4 в течение 20 мин (продукт LT) .

3. Полученные урокиназы, иммобилиэованной на фибриногене.

Реакцию связывания урокиназы с фибриногеном осуществляют сливанием продуктов I u II с последующей инкубацией смеси в течение 18 ч при 4 . Затем пролученный препарат о урокиназы, ковалентно связанной с фибриногеном,выделяют с помощью гельхроматографии илиультрафильтрации на приборе "Amikon" сфнльтром XM-IOO. (Процесс получения производных урокиназы иллюстрируется следующей

0 НМК

1) г -с +к;м=а=ы-к,-т -c.-о+ н,х-(сн,)„-ян, он NRg

1128601

О

II

-р NH cHI кн N-а и к

X .О О HNR, l II

tR,— N=C-М-К К -а — Π— С

ОХ 2,2) О HNR|

Ii

P -C-NH-(CÍð)„— NH+: C — Π— C — (Е—

МЯ

О р) -L-мн-(н,)„— мн- C-(E (I где P — белок (фибриноген) . где Š— фермент урокинаэа

Полученно производное урокиназы (tH) представляет собой урокиназу, ковалентно связанную с фибриногеном, являющимся строительным материалом тромба, и обладающую вследствие этого повышенным сродством к тромбу, З0

Включение подобного конъюгата в тромб за счет средства носителя (после взаимодействия с тромбином) с материалом тромба обеспечивает повышенную локальную концентрацию урокиназы на.поверхности тромба.

По-видимому, это происходит на всех участках тромбообразования, что обус ловливает возможность превращения подобных производных в сродство 40 системного тромбилизиса.

Включение в структуру производных фибриногена и урокиназы не позволяет с очевидностью предположить, что получаемые производные будут харак- 45 теризоваться тромболитической активностью с повышенным сродством к мате риалу тромба. Неожиданность достигаемого эффекта обеспечивается тем, что как урокинаэа, так и фибриноген, 50 относятся к элементам противоборству ющих систем в организме. Урокиназаактиватор плазминогена — элемент системы фибринолиэа, в то время как фибриноген — элемент системы сверты- 55 вания крови. Соединение этих элементов в одном производном предполагает возможное разрушение матрицы носителя (фибриногена) под каталитическим действием урокиназы, поскольку фибриноген являе ся субстратом для системы фибринолиза. Только структура агломератов — подшивка фермента к фибриногену через ножку диамина — позволяет урокиназе, с одной стороны, обладать определенной подвижностью, необходимой для эффективного тромболиза, а с другой стороны, препятствует разрушению носителя вследствие стерических затруднений, обусловленных модификацией фиброногена диамином.

Подобное связывание урокиназы с фибриногеном придает получаемым производным неочевидные, новые свой" ства:. наряду с тромболитической активностью повышенное сродство к материалу тромба. Влияние структуры получаемых агломератов на достигаеемый эффект проявляется в том, что матрица носителя (фибриноген) в результате известных превращений способствует встраиванию препарата в формирующийся тромб, основу которого составляет фибрин. Это обеспечивает достаточную эффективность действия таких препаратов, тромболитическая активность возрастает.

Полученное производное урокинаэы, ковалентно связанной с фибриногеном ((0 сохраняет около 50Х первоначальной эстераэной активности, опре1128601 деляемой по гидролиэу метилового эфира ацетилглициллизина (АСЬМе) .

По кинетическим параметрам гидролиэа этого субстрата полученное производное близко к нативному ферменту, а но термостабильности превосходит его рН-оптимум каталитической активности модифицированной урокиназы по гидролизу.АС1.Ме сдвигается в кислую сторону по сравнению с нативным ферментом, переходя в область физиологических рН. Преимущество производных заключается в повышении сродства их к тромбу, что в результате обеспечивает большую эффективность тромболизиса.

Кроме того, связывание фермента с высокополимерной матрицей, обычно повышает стабильность фермента в физиологических условиях, что озна чает удлинение сроков его действия и повышение эффективности ферментной терапии.

При исследовании свойств предлагаемых соединений сравнение проводили с нативным ферментом, так как известное производное урокиназы проявляет свойства, идентичные свойствам нативного фермента.

Пример 1. 7,83 мг фибриногена растворяют в 6 мл дистиллированной воды (3,8 ° 10 М) при комнатной температуре, раствор подкисляют с помощью HCl до рН 3,8 и затем добавляют карбодиимида. Через 10 мин когда рН раствора достигнет максимального значения (рН 4,5), отбирают 2 мл раствора активированного фибриногена, который добавляют на холоду (4 С) к 2 мл раствора додекаметилендиамина (3,8 10 M) в

0,1 M фосфатном буфере рН 8,3 и инку бируют смесь в течение 5.ч. После этого инкубационную смесь диализуют в течение 2 ч на холоду сначала против дистиллированной воды, а затем в тех же условиях против

0,02 М фосфатного буфера рН 8,3 (продукт I ).

Препарат урокиназы (24.000 1 U) растворяют в 2 мл дистиллированной воды и диалиэуют на холоду 2 ч против дистиллированной воды, затем еще 2 ч против 0 05 M фосфатного буфера рН 8,3. К отдиализованному раствору урокиназы добавляют 4 мг карбодиимида и инкубируют смесь 5

1О

ЪФ при перемешивании на холоду в течени

20 мин (продукт I» ).

После этого к раствору активиро- ванной урокинаэы (И) приливают 2 мл раствора фибриноген-додекаметилендиамина (I). Смесь инкубируют в течение 18 ч: при 4 С, затем полуо ченный препарат выделяют из реакционной смеси с помощью ультрафильтра. ции на "Ам сon" с фильтром ХМ-100.

Ь результате эксперимента с фибриногеном связывается 80Х урокинаэы, причем препарат сохраняет 50Х эстеразной активности от первоначальной.

Мол.мас. полученного продукта—

440000, содержание белка — 10 мас. X.

Пример 2. Процесс осуществляется.так же, как и в примере 1, за исключением того, что в качестве сшивающего реагента используется

1, 10-декаметилендиамин.

С фибриногеном связывается 90Х уро киназы, сохраняемая препаратом остаточная зстераэная активность составляет 45Х от первоначальной. Мол.мас. продукта — 420000, содержание белка — 12 мас.Х..

Пример .3. Процесс осуществляется так же, как и в примере 1, за исключением того, что в качестве сшивающего агента используется

1,7-гептаметилендиамин.

С носителем связывается 85Х уроки наэы, остаточная эстераэная активность производных урокиназа — фибриноген 30Х. Мол.мас. 400000, содержание белка 14 мас.X.

Пример 4. Процесс осуществляется так же, как и в примере 1, за исключением того, что в качестве сшивающего агента используется

Ф

1, 4-тетраметилендиамин.

К фибриногену присоединяется до

90Х урокинаэы. Препарат имеет остаточную эстеразную активность 40Х °

Мол.мас. 385000, содержание белка

15 мас.X.

П р и M е р 5. Урокиназу присоединяют к фибриногену непосредственно, без удлиняющего мостика алифатического диамина.

2 мл урокинаэы (12.000 1 U/ml),лиализуют 2 ч при 4 С против дистиллированной воды, а затем против

0,02 M фосфатного буфера рН 8,3.

К раствору урокиназы добавляют 2 мл активированного карбодиимидом фибриногена (3,8 ° 10 М) и 1 мл 0,1 М геном без помощи диамиыа) характерны максимальное значение Кц и минимальное значение К „, что означает резкое снижение активности этого производного по сравнению с нативной урокиназой.

Присоединение урокиназы к фибриногену сдвигает РН-оптимум каталитической активности фермента по гидролизу AGLMe в кислую сторону, Так, РН-оптимум нативной урокиназы—

8,3, РМ-оптимум продукта модификации урокиназы из примера 1 - 7 5. Это объясняется элиминированием отрицательного заряда карбоксильных групп в глобуле урокиназы при их активации карбодиимидом. Изменение остаточной каталитической активности урокиназы при ее модификации происходит следующим образом: активность фермента до модификации — 100X после стадии карбодиимидной активации — 88X после связывания с фибриногеном, модифицированным

1,12,додекаметилендиамином, — 57, после выделения полученного производного методом ультрафильтрации на

Il tt

Апасоп - 5 2 . Связывание фермента с полимерной матрицей фибриноге на наряду с т ем, что позволяет глоб уле фермента сохранять определенную подвижнос ть (изменения К» К „ и ), придает получаемому препарату биокатализатора повышенную стабильность, о чем говорят данные табл. 2.

ОпРеделение остаточной каталитическои активности проводили на

РН-стате по гидролизу 10 М раствора AGLMe в О, 1 М КС1 при РН 7,5 и комнатной температуре.

Экспериментальное определение тромболитической активности препаратов нативной и модифицированной урокинаэы быпо выполнено согласно известной методике (5), с добавлением в омывающий раствор 0,33 мг/мл плаэминогена человека. К 0 5 мл раствора (10 мг/мл) фибриногена приливают 0,2 мл раствора (4 мг/мл) тромбииа и выдерживают эту смесь 1 ч при комнатной температуре, за это время формируется фибриновый остов тромба. Его помещают на проницаемую пленку в закрепленную пластмассовую трубочку диаметром 1,0-1,5 см, дно которой омывается 15 мл раствора

О, 1 М фосфатного буфера рН 7,4.

В этом растворе растворяют плазмииф :-у

7 1128601 8 фосфатного буфера РН 8,3. Смесь инкубируют 18 ч при 4 С. Полученное проо изводное выделяют ультрафильтрацией.

С фибриногеном связывается 90 урокиназы, препарат сохраняет до 32 первоначальной эстераэной активности, Мол.:мас. 560000, содержание белка

30 мас.X.

Таким образом, присоединение урокиназы к фибриногену с .омощью раэ- 1О личных алифатических диаминов с предварительной карбодиимидной активацией исходных белков позволяет получать производные урокиназы, присоединенные к матрице носителя как 15 через ножки различной длины, так и без них.

Кинетические параметры каталитического гидролиэа такими препаратами низкомолекулярного субстрата AGLNe щ (РН 7,5; О,! М НС1, комнатная температура) незначительно отличаются от соответствующих констант нативной урокиназы. Об этом свидетельствуют данные табл. 1. В качестве объекта 25 сравнения использована нативная урокинеза, так как последняя в условиях эксперимента сопоставима с известным препаратом (3) .

-2

Концентрация AGLNe 10 -1О М, концентрация фермента в ячейке

100 IU/ml.

Как видно из данных табл. 1 лучшие кинетические параметры среди модифицированных препаратов уроки35 назы имеет продукт примера 1 — урокиназа, присоединенная к фибриногену с помощью 1, 12-додекаметилендиамина.

Использование самой длинной из имеющегося набора ножек позволяет получать препараты, наиболее близкие по свойствам к нативному ферменту.

По-видимому, длинная ножка в значительной степени устраняет неблагоприятное слияние на глобулу фермента со стороны матрицы, которое может проявляться в изменении конформационного состояния молекулы связанного фермента, в стерических затруднениях, возникающих при взаимодействии с субстратом и т.д. Это подтверждается сравнением кинетических характеристик нативной урокиназы и продуктов ее модификации. Так, по мере укорочения ножки для производных урокиназы возрастают величины К и уменьшаются величины К „ . Для продукта примера

5 (урокиназа, связанная с фибрино9 1128601 ген (0,33 мг/мл контроль), а также препараты нативнойи модифицированной урокиназы, которые берут в соотношении, обеспечивающем их одинаковую эстеразную (AGLMe) каталитическую активность.. 5 з

Эа растворением фибринового сгустка P следят по увеличению оптической плот- ( ности при h = 280 нм омывающего раствора т по времени. Результаты эксперимента 3 приведены в табл. 3.

IO

Отношение прироста оптической б плотности раствора (в результате р деструкции при тромболизисе нерастворимого фибринового сгустка и ф перехода его фрагментов в раствор) tS л к величине промежутка времени, за н который оно произошло, характеризует в скорость процесса тромболизиса (tga, т в такой системе. В контрольном экс-. в перименте значительного лиэиса фиб- 20 ф ринового сгустка не наблюдается. Э

Для препаратов же нативной и моди- а фицированной урокиназы (продукт т примера 1) значения tg 06 составляют соответственно 0,3 и 0,5, что сви- д детельствует о большой тромболитин ческой эффективности модифицирован- т ного производного и подтверждается P также значениями времени полного растворения тромба, составляющими 30 в

5 и 3 ч соответственно.

Окончательные результаты экспери- 3 ментов по тромболизису представлены к в табл. 4; м

Приведенные в табл. 4 данные показывают, что с ростом длины ножки использованного диамина растет эффективность тромболитического действия препарата модифицированной урокиназы.щ

Можно предполагать, что причина этого заключается в наиболее благоприятном соотношении у таких производных подвижности фермента, удаленности его от матрицы носителя и ее способности быть встроенной в материал тромба. Дальнейшее увеличение длины ножки нецелесообразно, так как утрачивается стабилизирующее влияние носителя и затрудняется его модифика- SO . ция такими бифункциональными реагентами, возрастающая гидрофобность которых сокращает их реальную длину (скручивание метиленовой цепи). Как показывают опытные данные, 12 мети- И леновых групп в цепи реагента - это близкая к оптимальной длина межмолекулярной сшивки.

Экспериментальное подтверждение возросшей тропности препарата модифицированной урокиназы к тромбу было предемонстрировано следующим обраом: сформировавшиеся сгустки фибина омывались определенное время

15 мин) растворами препаратов наивной и модифицированной урокиназы. атем сгустки переносили в растворы ого же буфера без фермента и инкуации в течение 3 ч. В этих раствоах определяли прирост оптической плотности, т.е. скорость растворения ибринового сгустка, причем контроем служил буфер, содержащий плазмиоген и омывающий фибриновый сгусток течение всего времени эксперимена. Показано, что происходит быстрое страивание и фибриновый сгусток ибриногена из омывающего раствора. то включение обнаруживается визульно уже через 5-15 мин (см. абл. 5).

Из данных табл. 5 следует, что ействие нативного препарата урокиазы (ted@ О,!5) по эффективности ромболизиса близко к данным контольного эксперимента (tg a 0,14).

Фибринолиз в контроле объясняется, ероятно, наличием в препарате плазминогена примесей плазмина . начительно большую тромболитичесую активность обнаруживает продукт одификации урокиназы из примера

1 (tgoC 0,3). Это означает, что именно это производное урокиназы обладает сродством к фибриновому сгустку, поскольку влючается в него при первой 15-минутной инкубации и переносится вместе со сгустком в буферный раствор, где в течение

3 ч продолжается фибринолитическое действие препарата. Более того, при повторении этого эксперимента с теми же фибриновыми сгустками несколько раз (до 5, см. табл. 5) обнаруживается, что производные урокиназы обладают способностью дополнительно встраиваться в уже лизирующийся тромб, о чем свидетельствуют возрастакяцие значения (от 0,3 до 0,46) tga характерного показателя эффективности тромболизиса. Как видно из табл. 5, подобная способность не свойственна нативной урокиназы, Синтез препаратов урокиназы, ковалентно связанных через алифатический диамин с фибриногеном, позв Il 112 ляет получить производные фермента, обладающие высокой тромболитнческой активностью, повышенной стабильностью и сродством к материалу тромба. Подобные производные урокинаэы представляют собой эффективные средства системного тромболизиса нролонгиро- ванного действия, которые могут быть использованы при инфарктах миоТаблица 1

Кинетические константы описываемых производньм урокинеэы

1Э

1 2 3 4 5

3,0 "10 11,0. 10 13 10 14" 10 15,0 10 18,0 10

К сек са

33

29 27

Таблица 2

Стабильность производных урокиназы

Сохраняемая препаратом остаточная каталитическая активность при инкубации при 50 С в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,5 через, ч

Препарат

3 7 14 24

Нативная урокиназа

10

80

Продукт примера

60

85

56

75

45

73

42

76

88

44

78

Кинетический пара- Нативная метр препарата урокинаэа

8601 12 карда, эмболиях легочных артерий, тромбозах сосудов головного мозга и ряде других заболеваний. Использование подобных препаратов урокиназы облегчит курс лечения и повысит его эффективность за счет. снижения расхода дорогостоящего фермента, удлинения срока,и обеспечения строгой направленности действия.

Продукт примера

Т T T (13

1128601

Таблица 3

Динамика растворения фибринового сгустка под воздействием производного урокиназы

Нативная урокиназа

Урокиназа-1,1,12-додекаметилендиаминфибриноген

Время, мин

А 7.30

90

43

150

42. 100

82

100

Таблица 4

Результаты тромболизиса

Время полного растворения фибринового сгустка, ч

Скорость растворения фибринового сгустка

tgК

Препарат

Нативная урокиназа

Продукт примера 1

0,3

0,5

3 ч 45 мин

0,43

0,40

4 ч 20 мин

0,36

5,5

0 25

0,292 О

0,326 0,034

0,383 0,091

1СО О, 418 О, 126

240 0,484 О, 192

270 0,539 0,247

300 0,592 0,300

0,842

0,809

0,971

1,083

1,144

О, 037

О, 129

0,241

О, 302

1128601!

Таблица 5

Результаты экспериментов по исследованию сродства производных к тромбу

Препарат

15

0,14

0,15

0,17

0,16

0,14

0,3

0,42

0,38

0,44

0,46

0,14

О, 14

0,14

О, 14.

Контроль

0,14

0,22

0,26

0,28

0,30

0,31

0,19

0,22

0,24

0,25

0,27

0,26

О, 16

0,20

0,23

0,25

0,11

0,12

0,12

0,14

0,15

Корректор В, Бутяга

Редактор Л. Письман

Заказ 4513/5

Тираж 525

Подписное

Нативная урокиназа

Продукт примера

Скорость растворения фибринового сгустка за 3 ч в растворе буфера после инкубации с препаратом в течение (в мин) 1

Составитель

Техред Т.Фанта

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, ЬЬсква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r . .Ужгород, ул. Проектная, 4