Рекомбинантная плазмидная днк @ ,способ конструирования плазмидной днк и штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции @

 

1. Рекомбйиантная плазмидиая ДНК pl.LRVSa размером 8,4 тысяч пар оснований состоит из фрагментрв ДНК фага лямбда размером 1,73 тысяч пар оснований и плазмидиой ДНК рВ8 322 размером 4,0 тыся1 Пар оснований и содерл1гт ген бета-лактамазы, ген фага лямбда и иаходясщеся под контролем правого промотора ранних генов фага лямбда Р,- гены системы рестрикции и модификацш :Есо RVj определяет синтез .эндонуклеазы рестрикции Есо RV. 8SIS О СЛ О fit 1ЧЭ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ1 КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3614966/28-13 (22) 25.04.83 (46) 23.12.84, Бюл. !(47 (72) А.А.Баев, А.Н.Края.=„-, А.С.Солонин, Н.П.Кузьмин, . А.Ф.Мороз,.

Л.И.Глатман и ВЛ.Таняшин (71) Институт. биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им!почетного академика Н.Ф.Гамалеи . (53) 575.113(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

i,rio заявке ff 3446651/13/09247 f, кл. С 12 R 1/19, 23.12.82(прототип)...3(51) С 1? N f5/00; С 12 R 1/19,,(54) РГКОМБИНАНТНАЯ ПЛА31 ПЩНАЯ ДНК р1ЖЧ8Ь, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЭМИДНОЙ ДНК И

ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ ЭНДОЧУКЛГАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ЕСОГУ. (57) 1. Рекомбинантная плазмидная

ДНК рП;НМЯд размером 8,4 тысяч пар оснований состоит из фрагментов

ДНК фага лямбда размером 1,73 тысяч пар оснований и плазмидной ДНК pBR

322 размером 4,0 тысяч пар оснований и содержит ген бета-лактамазы, ген ген фага лямбда и находяццеся под контролем правого промотора ранних генов фага лямбда Р„ гены системы рестрикции и модификации

Есо RV, определяет синтез .эндонукле. азы рестрикции Есо 1М.

1130602 трансформируют клетки E.col, лизогенные по фагу лямбда ct+ и из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют целевую рекомбинант плазмидную

ДНК.

2. Способ конструирования рекомбинантной ДНК plLRVRd методом генетической инженерии, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью увеличения выхода эндонуклеазы рестрикции EcoRV, рекомбинантную плазмидную ДНК pl L RV8 расщепляют эндонуклеазой рестрикции

Hind III, образующиеся фрагменты лигируют ДНК-лигазой фага Т4, полу.ченными кольцевыми молекулами ДНК

3. Штамм Escherichia coli ВКМ

8-4Д (Всесоюзная кол.,екция микроорганизмов прн ИБФМ ЛН СССР) — продуцент эндонуклеазы рестрикции Есо RV.

Изобретение относится к молеку- точном экстракте белков этого продулярной биологии, биотехнологии и цента — 15 10" ед/г биомассы 11) . микробиологической промышленности Недостатком сконструированного и представляет собой рекомбинаптную штамма является относительная его неплазмидную ДНК, способ конструирования стабильность, резко возрастающая рекомбинантной плазмидной ДНК опреде" с повышением температуры культивиI ляющей повышенныи синтез эндонуклеазы рования свыше 37ОС, что сказывается

Рестрикции Eco BV (R.Eco RV) и способ а конечном выходе фермента. В свяконструирования стабильного штамма- зи с этим необходимо проводить кульпродуцента эндонуклеазы Рестрикции 10 тнвирование штамма, содержащего плазЕсо Вч„сохраняющего свои свойства при мидную дНК, в диапазоне температур длит ельном KyJ1hтивировании, 30-34 С. Однако максимальное увеФермент Р,Eco RV исподьзуется в личение синтеза фермента достигается молекулярной биологии как в экспери . повышением температуры до 43 С при ментах по конструированию рекомби- 15 достижении клетками средней логарифнаптных ДНК in vitrо, так и при изу- мической фазы роста. Уровень активчении первичной структуры ДНК;,ности P.Eco RV в этом штамме недоИзвестен способ получения реком" статочно высок. бинантной плазмидной ДНК plLRV8, Цепью изобретения является увекоторая содержит гены системы рест-. 20 личе выхода фермента Б.Eco RV. рикцпи-модификации Eco RV, находящи- Поставленная цель достигается еся под контролем промотора фага . тем, что сконструирован делеционный лямбда Р„ . Уровень транскрипции вариант рекомбинантной плаэмидной с этого промотора регулируется тер- ДНК.pILRV8, названный p1LBV8D размочулствительным репрессором С1 25 мером 8,4 тысяч пар оснований, котоrett которого локализован в этой же рая состоит .из. фрагментов ДНК фага плазмнде. Плазмидная ljHK piLHV8 лямбда размером 1,73 тысяч пар осносконструирована с использованием наний и нлазмидной ДНК РВЛ 322 размефрагмента ДНК фага лямбда размером ром 4,0 тысяч пар оснований и содер2,5 тысяч пар оснований (тпо) и 30 жит ген бета-лактамазы, ген гех фага содержащего область иммУнитета s ro- лямбда и находящийся под контролем

ro фага.. правого проматора ранних генов фага лямбда Р,. гены системы рестрикции .Недостатком сконструированной и модификации Есо Рч, определяет синплазмпды pII„RVB является ее относи-. тез эндонуклеазы рестрикции Гсо HV.

35 тельная нестабильность при индук- Поставленная цель достигается такции экспрессии P.Eco RY. же тем, что согласно способу конИзвестен штамм-продуцент P,Åñî RY- струирования рекомбинантной ДНК

Escherichia coli ВКМ В-1455 Д. Уро- РХ „BVBd методом генетической инженевень активности R.Eco RV в бескле- 4< рни, рекомбинантную плазмидную ДНК

1130602

3

p1L3V8 расщепляют. эндонуклеазной рестрикции Hind III, образующиеся фрагменты лигируют ДНК-лигазой фага Т4, полученными кольцевыми молекулами ДНК трансформируют клетки

E.coli, лизогенные по фагу лямбда

cl+ и из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК.

Поставленная цель достигается также тем, что используют штамм

Е.coli BKN R-4Д (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР), в котором плазмидная PHK piLRVBa максимально стабильна и обеспечива. ет наибольш)",о экспрессию Р,Есо RV.

Рекомбинантная плазмидная Д!1К р 1 1.ВЧ8д размером 8, 4 тпо (схема плазмидной ДНК p1LRVSD представлена на фиг,1) содержит наряду с ге- 2О ном р -лактамазы, определяющим резистентность клеток к ы - .циллину, находящиеся под контролем -.:ромотора фага лямбда Р гены системы рестрикt ции-модификации Есо Rv и представля- 25 ют собой ДНК plLRVB с делецией по

EEind III сайтам в области генов фага Л c l u I.ex

Сущность способа конструирования ЗО предлагаемой плазмиды plLRVBd состоит в том, что ДНК лазмиды р?1.РЧ8 расщепляют,эндонуклеазой Hind III

t и после обработки ДНК-лигазой фага

Т4, кольцевыми молекулами ДНК

35 трансформируют клетки Е.coli, лиэогенные по фагу Л c I и отбирают клоны по признаку устойчивости клеток к ампициллину.

Отбор клеток, .содержащих plLRVBh> 411 может быть осуществлен с помощью любого лабораторного штамма Езсйеrichia co1i, лизогенного по фагу Л например, Е.coli К802 (Л); Е.coli

С600 (iE); E.coli HE3101 (Л); Е.col з. .М 3350 (Л), С 5183 (Л).

Из oTpe1IhHbK KJIOHOB выделяют»IB= дивидуальную плазмидную ДНК.

В качестве контроля используют трансформацию клеток E.coli J C5183, нелизогенных по фагу лямбда, такие клетки делеционными вариантами плазмид не трансформируются (фиг.2).

Штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции Eco RV получают трансфор- 55 мацией плазмидной Д11К pjLPVB штамм

Е.coli J C5183/(pLG13, pLG14) . В этом штамме плазмидная ДНК р 1LRV85 максимально стабильна и обеспечивает повышенный синтез фермента при. постоянной температуре культивирования (фиг.2).

Штамм Е.cali J C5183, содержащий плазмиды plLRVBD, р?.Г13 и pLG14> депонирован во Всес.оюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ ЛН СССР под номером ВКМ P=4 Д.

Штамм Е.coli ВКМ R-4Д характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы 1,2-1,6;

2,0;,6,0 мк, подвижные, с перитрихиальньыи жгутиками, грамм-отрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки, Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонном агаре, питательном агаре "Дифко колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, серые, край ровный, мутные ° При росте в жидких средах: мясо-пептонном бульоне, в 1 В-бульоне образуют ровную интенсивную муть.

Физиолого-биохимические признаки °

Растут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5, В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: с1,-глюкозу, 2 -фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу, не усваивающий ацетат, аданнт.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме и в виде пентона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до питритов. Желатину не разжижают. Уреазная активность не обнаруживается. Индол не образуют.

Устойчивость к антибиотикам. Проявляет устойчивость к ампициллину.

Генетические признаки штамма: Eco НФ п Есо gV наес Вс, sbcB, Г, thy 1, реп 6, pro A2, his 4, thi 1, arg Е, lac 41, gal К2, ara 14»

xyl 5, met-1, tsx-33.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК piLRV86.

Плазмидную ДНК p1LRVB выпеляют из штамма ВКИ В-1455 Д по методу (Clevell, He1ineky, 1969, PNAS, 62, 1159-1163) .

2 мкг выделенной ДНК гидролиэуют рестриктазой Нжд Ш в 100 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС, рН 7,8, 10 мМ MgC1, 2 мМ 2-меркапто этанола, 20 мМ NaC1 при 37 С 1 ч.

После прогревания реакционной смеси при 65 С в течение 10 мин проводят чкольцевание" фрагментов ДНК-ДНК лигазой фага Т4 в присутствии АТФ (100 мкМ) при концентрации ДНК

0,5 мкг/мл (+ 10ОС, 14 ч) . Смесью образовавшихся модекул трансформируют клетки F..coli С5183 (licl ). Получение компетентных клеток штамма и трансформацию проводят по методу (Cohen S.М., Chang А.С.Х., Hau R., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114, 1972). Селекцию клонов, содержащих плаэмиды, проводят на. твердой агаризованной среде в присутствии 30 мкг/мл ампициллина при

37 С.

Иэ выросших колоний выделяют индивидуальную плазмидную ДНК ускоренным методом щелочного лизиса (Birnboim Н.С, Doly J ° Nucl. Acid.

Res 7, 1513-1523, 1979) и выделенной пйазмидной ДНК трансформируют клетки штаммов F.coli J C5183 и

Е.со1i 1 С5183 (ЪсТ+). Плазмидные

ДНК, способные трансформировать лизогенные штаммы Е.coli 3 С5183 (h с1+) с частотой не менее 10 коло ний/мкг плазмидной ДНК, не трансформирующие клетки штамма Е.coli

J С5 183, используют для дальнейшего анализа.

1130602 б мазы, определяющий резистентность клеток к ампициллнну, правый промотор ранних генов фага .лямбда Р и ген этого фага Л „„(Matr К., Schmandt M., Gussin С.М. Genetics., 102:319-327, 1982). Делеционная инактивация гена репрессора С1 в составе плазмидной ДНК р11.ЯЧЯ приводит к полной инактивации гена !

О репрессора С i,ñooòBåòñòâåíío, к дерепрессии транскрипции с промотора

Р и увеличению уровня синтеза эндонуклеазы рестрикции Есо РЧ.

1,3

Вр II-Pst i 3 .

В, Pst1-Pst1 3,8

С Pst1-PstI 1,6

BgIII-HindIII 1 2

Н ind-Ps tI 0,2

1,2

PstI-Hind III 0,36

Г

G HindIII-Ндпд?11 О, 13

Н HindIII-Bg III 0,52

0,52!

РР Фрагмент p i LRV8 р1ЬКЧ8В* пп о

Рестрикционный анализ проводят З5 с помощью эндонуклеаз рестрикции

В8 III, Pst 1, Hind III Среди трансформантов отбирают ДНК двух типов: содержащих по одному участку узнавания для эндонуклеазы Hing III u по два участка узнавания для этой эндонуклеазы рестрикции. Размеры фрагментов ДНК,-образующихся при рестрикционном анализе, представлеHb1 в таблице. Плазмидную ДНК с наи- 4S большей делецией (потеря обоих

Hind ТХХ фрагментов.0,560 тпо и

0,125 тпо), названную p1LRv8d, используют для получения штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции S0

Есо Нч.

Плаэмидная ДНК р11,КЧ8й, схема которой показана на фиг.1, имеет общий размер 8,4 тпо, состоит из участков ДНК лямбда (1,73 тпо), плазмидиой ДНК рВК 322 (4,000 тпо) и содержит гены системы рестрикции и модификации Есо Rv, ген беталакта9,0

8,4

* — размер фрагментов в тпо.

Пример 2. Конструирование штамма ЕзсЬег chia coli ВКМ R-4Д.

Клетки штамма Е.cali 1 С 5183/ (pLG 13, pLG 14) (Glatman L. e t al.

UII International colloqium on Laboratory methods for epidemiological

surveillance р.22, Wernigorode DDR, 1981) подращивают до титра 2-3 1О клеток/мл, затем собирают их центрифугированием при 6000 15 мин при О С, суспендируют в равном объеме О,1 М

CaCl,. выдерживают при О С не менее

1 ч, повторно осаждают клетки при

6000 g О С и суспендируют в О, 1 M

СаСР2 в десятой части исходного объема (компетентные клетки).

1 мкг ДНК piI.IIVRd в 50 мкл раствора 10 мИ трис-НС0, рН 8,0, 1 MM

ЗДТА смешивают с 100 мкл компетентных клеток, инкубируют 20 мин во

1!30602 8 льду, затем 2 мин при 40 С и 10 мин определяется наличием в шталме — пропри комнатной температуре, добавляют дуценте плазмидной ДНК РЬС 13.

1,3 мл 1.В-бульона и инкубируют 2 ч В штамме BKH R-4Д проэеряют уропри 37 С с интенсивной аэрацией. вень синтеза H.Есо Кч нри постоянСуспензию высевают на агаризованную 5 ной температуре культивирования 37 С. среду с 30 мкг!мл ампициллина Культуру подращивают в 1 л среды (100 мкл/чашку Петри). Схема получе- до 5 -10 клеток/мл. Клетки осаждают ния штамма представлена на фиг.2. центрифугированиеи при 6000 15 ла н, Анализ штамма Escherichia coli и 0,9 г. (сырой вес) биомассы суспе ВКМ-P-4Д. 10 дируют в 6 мл буфера, содержащего

Из отдельных выросших колоний вы- 50 мМ трис-НС1; РН 7,6;0,2 М ИаС1, деляют индивидуальную плазмидную 3 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл, ДНК и по 1 мкг используют для повтор. лизоцима и выдерживают при О С 40 мин, ной трансформации клеток Е.со11 Клетки разрушают ультразвуком ф

Э

J С 5183 (Л c1 ) и Е.cali 3C5183.. 15 экстракт получают центрифугированием

Селекцию клонов, содержащих рекомби- при 2 С (48000), Активность R.Eco HV нантную плазмиду p1LHv8rr, проводят определяют в серийных разведениях

1, по резистентностн клеток к ампицил- супернатанта: 1 /1 00; 1 /500; 1 /1 000; лину (30 мкг!мг) . 1/5000; 1/25000 1/50000, 1 мин ДНК

Стабильность фенотипа, определяе- 20 фага лямбда инкубируют в 30 мкл инкубамого РО Н1/ЯЬ, изучают в клонах, дНК ционной смеси (5 мИ трис-НС1 РН 7,6; которых трансформирует E col i 50 мИ NaCl; 10 мИ NgCl ; 6 мИ 2-мерJ С5183 (Ь с1 ) с частотой 0,5-1.10, каптоэтанола) с 2 мкл йз каждого а штамм Е.coli J C5183, нелизогенный: разведения. Уровень активности эндопо фагу лямбда с частотой 1-5 ..10 . 25 нуклеазы рестрикции Гсо EW в бесклеКлетки отобранных клонов инокулиру- точном экстракте: штамма ВКМ R-4Д— ют в 10 мл бульона LB и растят при около 20 ° 10 ь ед. в пересчете на 1 r

37 С с усиленной аэрацией до -ранней биомассы. стационарной фазы (2-3 ° 10 клеток/мл) Такии образом, плазмидная ДИК

)50-тью мкл клеток заражают повторно зО р1ЬЮЯ 4, содержащая промотбр Ранних

f0 мл LB, Процедуру повторяют еще генов фага лямбда и гены рестрикципраз (всего 3 цикла). На завершающем модификации Eco RV, определяют повыэтапе делают серийное разведение шенный синтез R.Åñî RV, не зависящий культуры и высевают на чашки с ага- от температуры культивирования клеток ризованной LB-средой, не содержащей 3> BKM R-4Д. антибиотика. При проверке 500 коло- Предлагаемый способ конструирований на наличие маркера резистентния Рекомбинантпой плаэмидной ДНК ности к-ампициллину и способности обеспечивает повьш енный синтез. е- . ограничивать бактериофаг Ъ ч т, 0 штез. Ре- . стриктазы Есо RV за счет транскриппоказано, что утери сцепленных с 40 ции с промотора Р, под контролем плаэлпщой р1 В 8 6 генетических марЭ которого находятся гены системы .Ре- . керов не происходит. Частоты тран- стрикции-модификации Есо В" в состасформацией лизогенного и нелизогенного штаммов Е.coli J C5183 плазве плазмпдной ДНК. Эффективность транскрипции с последнего не зави-мидными ДНК, выделенных из десяти не-, .5 сит от температуры культивирования. зависимых клонов этой серии частот, Ш амм Г обычно равно 20:1, что характерно амм Г 1 ВКМ К 4Д продуцент специфической эндонуклеаэы для передачи несцепленных признаков Есо Rv б со обеспечивает повышенный уроСледовательно, плазмидные ДНК

p1LHV8d, PLG 13, pLG 14 ведут севень. содержания фермента не менее р Ч й, p,,p ведут се 50 20-25 10 ед на l г сырого вещества бя как отдельные структурные едини- б1юмассы клеток, что в 7 раза цы.

В превосходит уровень синтеза R.Eco RV в клетках E.coli ВКИ В-1455 Д. Этот

Сконструированный штамм Е.col i уровень достигается без температурBKN R-4Д обе и с ечивает стабильное 55 нои индукции при культивировании. подцержание плазмиды p1LRVSA во вре- В штамме Е.coli ВКМ В- 4Д наблюцается мя длительного культивирования в не- стабильное подцержание плазмидной .селективных условиях. Это свойство JlHK p1LRV8rr, что позволяет культиви9 1130602 !О. пригодным для использования как в лабораторных условиях, : так и на промышленных установках.

МлФЛ ° 1

Лагам Ж

ИпФШ рвнирориацоя

Е; c0li

Редактор Н.Яцола Техред,С.Йовжий Корректор В.Бутяга

Заказ 297 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытйй

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент"., г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ровать его в больших обьемах (полупромышленные установки).

Таким образом перечисленные свойства штамма делают его

Nin

8@LE

PstI

Hindgut

8уЫ

Оозюачевгя:

8з -РЛУР8ю

73 -РИАЗ.

1Ф-рЬИ4