Питательная среда для культивирования почвенных микроорганизмов
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗ.МОВ , включакицая азотнокислый калий, фосфорнокислый калий двузамещенный хлорное железо и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что, с целью более полного выявления общего количества диссимилирукщих нитраты микроорганизмов в почве, а ; также обнаружения спорообразуннцих и восстанавливающих нитраты до нитритов микроорганизмов этой группы, среда дополнительно содержит мясопептонный бульон, уксуснокислый натрий, молочнокислый натрий, яблочнокислый натрий при следующем соотношении компонентов , г/л: Азотнокислый калий8,0-12,0 Фосфорнокисльш калий двузамещенный0 ,9-1,0 Хлорное железо 0,01-0,03 Мясопептонный бульон90-100 Уксуснокисльй 0,4-0,6 натрий О) Молочнокислый 1,3-1.7 натрий Яблочнокислый 0,4-0,6 натрий Вода дистиллироДо 1 л ванная
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
0% (И) 4(59 С 12 Х 1/00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
0,9-1,0
0,01-0,03
0,4-0,6
0,4-0,6
Ф %
° °
° °
Ъю (21) 3616541/30 — 15 (22) 30.06.83 (46) 07.01.85 Вюл. и 1 (72) Т.К.Ильина и О.М.Фомина (71) Ордена Трудового. Красного Знамени почвенный институт им.В.В.Докучаева (53) 579.64:631.484(088.8) (56) 1. Теппер Е.З. Шильникова В.К. и Переверзева Г.И. Практикум по микро биологии. М., "Колос", 1979, с. 144 (прототип) . (54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗ—
МОВ, включающая азотнокислый калий, фосфорнокислый калий двузамещенный, хлорное железо и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что„ с целью более полного выявления общего количества диссимилирующих нитраты микроорганизмов в почве, а также обнаружения спорообразующих и восстанавливающих нитраты до нитритов микроорганизмов этой группы, среда дополнительно содержит мясопептонный бульон, уксуснокислый натрий, молочнокислый натрий, яблочнокислый натрий при следующем соотношении компонентов, г/л:
Азотнокислый калий 8,0-12,0
Фосфорнокислый калий двузамещенный
Хлорное железо
Мясопептонный бульон 90-100
Уксуснокислый натрий
Молочнокислый натрий 1,3-1,7
Яблочнокислый натрий
Вода дистиллированная До1л
1133289
Цель достигается тем, что питательная среда для культивирования.:почвенных микроорганизмов, включающая азотнокислый калий, фосфорнокислый 40 калий двузамещенный, хлорное железо и дистиллированную воду, среда дополнительно содержит мясопептонный бульон, уксуснокислый натрий, молочнокислый натрий, яблочнокислый натрий при следующем соотношении компонентов, г/л:
Азотнокислый .-калий 8,0-12,0
Фосфорнокислый . калий двузамещенный 0,9-1,0
Хлорное железо 0,01-0,03
Иясопептонный бульон 90-100
Уксуснокислый 55 натрий
Иолочнокислый натрий 1,3-1,7
0,4-0,6
Изобретение. относится к почвенной микробиологии и может быть использоI вано для характеристики биологической активности и изучения азотного режима почв. 5
Известно использование для обнаружения микроорганизмов, диссими-, лирующих нитраты, среды Гильтая, для приготовления которой берут два раствора.. Первый раствор содержит, г: !О азотнокислый калий 2, 1; аспарагин 1,0;; дистиллированная вода 250 мл. В состав второго раствора входят, г:
JfHMoHHoKHclIbIH натрий 5,0, фосфорнокислый калий двузамещенный 2,0; сер- 15 нокислый марганец 2,0; хлорное железо следы; дистиллированная. вада
500 мл. Оба.раствора сливают вместе, устанавливают рН 6;8-7,0 и объем доводят до 1 л. Подсчет проводят 20 методом предельных разведений, с помощью которого на среде Гильтая по мутности, изменению рН и газообразованию определяют количество денитрификаторов (1 .
GpHBKo на известной среде невозможно разграничить на группы. диссимилирующие нитрат микроорганизмы, а также выявить споровые формы.
Целью изобретения является более ЗО полное выявление общего количества диссимилирующих нитраты микроорганизмов в.почве, а также обнаружение спорообразующих и восстанавливающих
HHTpBTbI до нитритов микроорганизмов этой группы.
Яблочнокислый натрий 0,4-0,6
Вода дистиллированная До1л
Значение рН среды доводят до
7,5-8,0. Среду разливают в пробирки по 10 мл, закрывают ватными пробка ми, стерилизуют при 0,5 атм давления пара и инкубируют в анаэробных или микроаэрофильных условиях.
При, подборе среды, удовлетво— ряющей физиологические потребности большинства компонентов диссимилирующей нитраты микрофлоры почвы, приняты во внимание следующие сообра жения. Осуществление процессов биологической денитрификации в почве происходит за счет использования боковых алифатических полипептидов молекул гумусовых веществ в качестве источника углерода.и энергии.
Следовательно, рекомендуемая среда ближе по составу .к природной почвенной среде обитания диссимилирующих нитраты микроорганизмов, поскольку она приготовлена на основе разбавленного мясопептонного бульона.
Кроме того, эта среда отличается от известной присутствием комплекса солей органических кислот, легко доступ. ных для большинства денитрификаторов, а также повышенной в пять раз концентрацией нитрата и более высоким содержанием железа, стимулирующего денитрификацию.
Количество диссимилирующих нитраты микроорганизмов, выросших на этой среде, подсчитывают методом предельных разведений по качественным реакциям на присутствие нитрата и нитрнта. Таким образом, предлагаемая среда позволяет обнаружить различные группы диссимилирующих нитраты почвенных микроорганизмов, что дает возможчость одновременно учесть количество обеих групп микроорганизмов, осуществляющих процессы нитратного дыхания, денитрифицирующие, а также микроорганизмы, восстанавливающие нитрат до нитрита. Кроме того, на предлагаемой среде развиваются и спорообразующие формы этих микроорганизмов. Предлагаемая среда обозначена ГНД (согласно ее назначению — выявлению микроорганизмов группы нитратного дыхания с учетом большего количества входящих в ее состав компонентов).
1133289
О, 009 хлорное
Мясопептонный бульон
Уксуснокислый натрий
Молочнокислый натрий
0,3
Для обнаружения нитратов и нитритов в среде ГНД используют два реактива в виде смеси веществ. Первьй готовят растиранием 1 г сульфани— ловой кислоты и 2 r aC -нафтиламина в ступке пестиком. Добавляют 100 г сульфата бария и 75 г лимонной кислоты, тщательно перемешивают все компоненты. Второй реактив готовят из
10 г сернокислого марганца и 2 г 10 цинковой пыли, также тщательно расr терных и перемешанных в ступке.
В 0,5 — 2 мл культуральной среды проводят качественные реакции. Добавляют пять капель ледяной уксусной 15 кислоты и на кончике скальпеля первый реактив. Отсутствие красного окрашивания является показателем того, что. весь нитрат восстановился до газо. образных форм азота в процессе де- 2ь нитрификации. Появление красного окрашивания свидетельствует о вос- становлении нитратов .до нитритов.
С пробирками, в которых отмечался.,Ц рост, но нитрит не был обнаружен, "о 25 ступают следующим образом. Добавляют на кончике скальпеля второй реактив.
Отсутствие красного окрашивания означает, что весь добавленный нитрат денитрифицировался. Появление красного окрашивания констатирует наличие незатронутого или остаточного нитрата. Эти пробирки при подсчете количества денитрификаторов, соответственно принимаются или не 3 принимаются во внимание.
Подсчет диссимилирующих нитраты микроорганизмов производят через три недели после посева. Количество- 40 различных групп микроорагнизмов осуществляющих процессы нитратного дыхания, устанавливают по таблице
Narc-Креди.
Для определения количества спо- 45 рообразующих микроорганизмов обеих групп, денитрификаторов и восстанавливающих нитраты до нитритов проводят параллельный посев пастеризован. ной суспензии почвы на средах иэ- 50 вестной и ГНД. Результаты исследований показали, что на известной сре де спорообразующие формы микроорганизмов, обладающих способностью к осуществлению процессов нитратного 55
-дыхания, не развиваются. Среда ГНД обеспечивает условия для развития этих микроорганизмов.
pL
Пример 1. Используют среду состава, г/л: азотнокислый калий 10,0 фосфорнокислый калий двузамещенныв
1,0, хлорное железо 0,02) мясопептонный бульон ОО, уксуснокислый натрий 0 5; молочнокислый натрий 1,5; яблочнокислый натрий 0,5; вода дис- . тиллированная до 1 л. Устанавливают рН 7,5-8,0. Среду разливают по 1О мл в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм.
Затем пробирки со средой инокулируют
1 мл почвенной суспензии соответствуюших разведений. Инкубируют в
РЮ анаэростате при .28 С в течение 3 нед. Отбирают пробирки со средой, где отмечается рост микроорганизмов (по мутности). Из этих пробирок оставляют 0,5-2 мл на анализ. Добавляют пять капель ледяной уксусной кислоты и О, 1 г первого реактива.
Пробирки, .в котррых красное ок рашивание присутствует, используют для количественного подсчета микро:организмов, восстанавливающих нитраты до нитритов. К культуральной жидкости пробирок с отсутствием красного скрашивания добавляют второй реактив.
Отсутствие красного окрашивания свидетельствует о полном восстановлении нитрата до газообразных форм азота.
Эти пробирки используют для количест. венного подсчета. денитрификаторов. . Присутствие красного окрашивания указывает. на наличие нитрата. в среде. Эти пробирки отбрасывают. Количество микроорганизмов подсчитывают методом предельных разведений.
Полученные данные представлены в табл.1.
II р и м е р 2. При уменьшении навески ингредиентов предлагаемой сре-, ды получены данные, представленные в табл.2.
Таким образом, при соотношении ингредиентов в среде, г/л:
Азотнокислый
:;калий 7,0
Фосфорнокислый калий двузамещенный 0,8
Железо
1133289.
110
Таблица
Почва Глубина. см
Горизонт
Среда ГНД
Неепоровые Споровые Неспоровые Споровые
Типичный
1,8 10
1,1 10
2,7 ° 10
5,9 ° 10
1,4 10
4,3 10
5,5>10.
6,8 10
0-5
Ао
5-15
15-45
4,9 10
А В 2,0i10
В 81 10
45-120
7,9 10
Таблица 2
Глубина, Горисм зонт
Известная оные Сп
Среда ГНД
Почва
Неспор оровые Неспоровые Споровые
Типичный
ПОДЗОЛ
3,2 10
5,2 ° 10
3,2 10
4,5 ° 10
1,01 11I0
1,5 10
2,0 ° 10
1,0 10
1,2-10
1,0 10
Я
2,0 10
3,2 ° 10
0-5
15-45
45-120
А2В
ЯблОчнОкислый натрий 0,3 количество денитрификаторов значительно уменьшается.
Пример 3. При увеличении навески ингредиентов получены следующие результаты (табл.3), Таким образом, при соотношении ингредиентов в среде, г/л:
Азотнокислый натрий 12,0
Фосфорнокислый калий двузамещенный 1,1
Железо хлорное 0,03
Мясопептонный бульон
Уксуснокислый натрий 0,6
Иолочнокислый натрий 1,7
Яблочнокислый натрий 0,6 количество денитрификаторов практически равно приведенному в табл.1,, поэтому нет смысла увеличивать навески использованных веществ в целях их экономии.
ll33289
Таблица 3
Горизонт
Среда ГНД
Почва
Глубина, см
Неспоровые Споровые
Неспоровые Споровые
Типич ный
1,6 10
6,7 10
5,7 ° 10
6,8 10 подзол
0-5
5-15
4,7 10
7,7 10
1,8 10
8,0 10
1 5-45
А2В
45-120
Составитель М. Мирзаев
Техред Т.Маточка
Корректор А.Обручар
Редактор Н.Дхуган
Подписное
Заказ 9923/25 Тирах 525
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ухгород, ул. Проектная, 4
2,0 ° 10
1,0 104
2,5 10
5,7 ° 10